Content

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   Inhaltsverzeichnis
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   1. Zusammenfassung
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   Kapitel 2
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  2. Einleitung
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  2.1. Das Immunsystem
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   2.1.1. Das angeborene Immunsystem
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   2.2. DAMPs
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   2.3. Die S100-Proteinfamile
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  2.3.1. S100A12
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   2.3.1.1. Struktur von S10012
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   2.3.1.2. Bindung zweiwertiger Kationen durch S100A12 und deren Einfluss auf die Proteinstruktur und -funktion
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   2.3.1.3. Funktionen von S100A12
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   2.4. TLRs
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   2.4.1. Signalleitung über TLR-4
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   2.5. Zielsetzung
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   Kapitel 3
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  3. Material und Methoden
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  3.1. Material
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   3.1.1. Allgemeine Chemikalien und Reagenzien
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   3.1.2. Puffer und Lösungen
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   3.1.3. Medien und Lösungen für die Zellkultur
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   3.1.4. Medien zu Kultivierung von Bakterien
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   3.1.5. Eukaryotische Zelllinien
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   3.1.6. Bakterienstämme
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   3.1.7. Antibiotika
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   3.1.8. Proteine und Standards
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  3.1.9. Antikörper
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   3.1.9.1. Primäre Antikörper
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   3.1.9.2. Sekundäre Antikörper
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   3.1.10. sonstige Detektionsreagenzien
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   3.1.11. Primersequenzen
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   3.1.12. Vektoren
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   3.1.13. Enzyme
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   3.1.14. Kits und Protokolle
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   3.1.15. Verbrauchsmaterialien
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   3.1.16. Laborausstattung
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   3.1.17. Software
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  3.2. Methoden
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  3.2.1. Zellkultur
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   3.2.1.1. Allgemeines
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   3.2.1.2. Kultivierung von HEK293- und HEK293/TCM-Zellen
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   3.2.1.3. Kultivierung von THP1-Zellen
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   3.2.1.4. Kryokonservierung von Zellen
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   3.2.1.5. Revitalisierung kryokonservierter Zellen
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   3.2.1.6. Zellzahlbestimmung
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  3.2.2. Arbeiten mit Escherichia coli (E. coli)
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   3.2.2.1. Kultivierung von E. coli
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   3.2.2.2. Kryokonservierung von E. coli
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   3.2.2.3. Herstellung chemisch kompetenter E. coli
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   3.2.2.4. Transformation chemisch kompetenter E. coli
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  3.2.3. Molekularbiologische Methoden
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   3.2.3.1. Präparation plasmidischer DNA
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   3.2.3.2. Konzentrationsbestimmung von RNA und DNA
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  3.2.3.3. Enzymatische Behandlung von DNA
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   3.2.3.3.1. Analytische und präparative Restriktion
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   3.2.3.3.2. Ligation der mutierten S100A12-DNA in pEF-IRES
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   3.2.3.4. Gelelektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten
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   3.2.3.5. Nachweis der Genexpression
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   3.2.3.6. Site-directed Mutagenesis
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   3.2.3.7. Sequenzierung
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   3.2.3.8. Stabile Transfektion von HEK293-Zellen
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  3.2.4. Proteinbiochemische Methoden
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   3.2.4.1. Rekombinante Expression von Proteinen in HEK293-Zellen
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   3.2.4.2. Rekombinante Expression von Protein in E. coli BL21(DE3)
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  3.2.4.3. Aufreinigung der in E. coli exprimierten Proteine
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   3.2.4.3.1. Anionenaustauschchromatographie (AIEX)
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   3.2.4.3.2. Kalzium-abhängige hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)
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  3.2.4.4. Aufreinigung der in HEK293-Zellen exprimierten Proteine
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   3.2.4.4.1. Konzentrationsbestimmung von Proteinen
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   3.2.4.5. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
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   3.2.4.6. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
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   3.2.4.6.1. Coomassie-Färbung
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   3.2.4.7. Westernblot (WB)
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   3.2.4.8. Densitometrie
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   3.2.4.9. Stimulation von HEK293/TCM-Zellen
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   3.2.4.10. Stimulation von THP1-Zellen
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   3.2.4.11. Entfernung von LPS mittels EndoTrap
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   3.2.4.12. Bestimmung der LPS-Konzentration mittels EndoLISA
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   3.2.4.13. Chemische Quervernetzung von Proteinen
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   3.2.4.14. Größenfiltration der Proteine
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   3.2.5. Statistik
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   Kapitel 4
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  4. Ergebnisse
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   4.1. Isolierung einzelner S100A12-Komplexe durch Größenfiltration
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  4.2. Herstellung von S100A12-Mutanten
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   4.2.1. Site-directed Mutagenesis
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   4.2.2. Proteinexpression in Säugerzellen (HEK293)
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   4.2.3. Vergleich der Proteinexpression im Zytosol und in Einschlusskörpern von E. coli BL21(DE3)
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  4.2.4. Proteinaufreinigung aus E. coli BL21(DE3)
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   4.2.4.1. Anionenaustauschchromatographie
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   4.2.4.2. Etablierung der HIC-Aufreinigung für die S100A12-Mutanten
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   4.2.4.3. Entfernung von Endotoxinen
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   4.2.4.4. Qualitätskontrolle der aufgereinigten Proteine
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   4.3. Bindungsverhalten mono- und polyklonaler Antikörper
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  4.4. Analyse der Komplexbildung
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   4.4.1. Kalzium- und Zink-abhängige Oligomerisierung von wtS100A12
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   4.4.2. Kalzium- und Zink-abhängige Oligomerisierung der Kalziumbindungs-Mutanten
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   4.4.3. Kalzium- und Zink-abhängige Oligomerisierung der Zinkbindungs-Mutanten
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  4.5. Funktionelle Analysen der S100A12-Mutanten
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   4.5.1. Das S100A12-Hexamer zeigt die effektivste Bindung an TLR-4 und RAGE
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   4.5.2. Analyse der Protein-TLR-4-Interaktion im ELISA
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   4.5.3. Analyse der Protein-RAGE-Interaktion im ELISA
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   4.5.4. TLR-4 vermittelte Stimulation von HEK293/TCM-Zellen
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   4.5.5. TLR-4 vermittelte Stimulation von THP1-Makrophagen
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   4.5.6. Stimulation von THP1-Makrophagen in Anwesenheit eines TLR4 Antikörpers
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   Kapitel 5
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  5. Diskussion
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  5.1. Darstellung verschiedener S100A12-Komplexformen
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   5.1.1. Aminosäureaustausch durch Site-directed Mutagenesis
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   5.1.1.1. Die Mutationen der Kalzium- und Zink-bindenden AS haben unterschiedliche Einflüsse auf die tertiäre bzw. quaternäre Proteinstruktur
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  5.2. Charakterisierung der extrazellulären S100A12-Rezeptor-Interaktion
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   5.2.1. Die Rezeptorbindung ist unter extrazellulären Bedingungen am effizientesten
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   5.2.2. Alle S100A12-Mutanten können die Rezeptoren TLR-4 und RAGE binden
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   5.2.3. Hexameres S100A12 ist für die Signalweiterleitung über TLR-4 essentiell
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   5.2.4. Stimulation der THP1-Makrophagen nach TLR-4 Blockade
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   5.3. Schlussfolgerung und Ausblick
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   Kapitel 6
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   6. Literaturverzeichnis
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   Kapitel 7
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  7. Anhang
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   7.1. Abkürzungsverzeichnis
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   7.2. Abbildungsverzeichnis
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   7.3. Tabellenverzeichnis
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   7.4. Weitere Tabellen und Abbildungen
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   7.5. Eidesstattliche Erklärung