Stümpel, Frank Thomas: Untersuchungen zum Einfluss der cAMP-regulierten Transkriptionsfaktoren Activator Protein 2Alpha (AP-2Alpha) und cAMP Response Element Modulator (CREM) [...]. 2009
Inhalt
- 1 Einleitung
- 1.1 Herzinsuffizienz
- 1.2 Apoptose
- 1.3 Der Transkriptionsfaktor AP-2α
- 1.4 Der Transkriptionsfaktor CREM
- 1.5 Fragestellung, Ziele und Ergebnisse
- 2 Material und Methoden
- 2.1 Tierlinien
- 2.2 Langendorff-Perfusion
- 2.2.1 Beschreibung des Verfahrens
- 2.2.2 Präparation der Herzen
- 2.2.3 Ablauf des Versuchs
- 2.2.4 Verwendete Lösungen
- 2.3 Nachweis von DNA-Fragmentierung
- 2.3.1 DNA-Gewinnung
- 2.3.2 Gelelektrophorese
- 2.3.3 Auswertung
- 2.3.4 Verwendete Lösungen und Standards
- 2.4 Western Blots
- 2.4.1 Gewebeaufarbeitung
- 2.4.2 Gelelektrophorese und Blot
- 2.4.3 Immunologischer Nachweis von gespaltenem Lamin A und Calsequestrin
- 2.4.4 Auswertung
- 2.4.5 Verwendete Lösungen und Chemikalien
- 2.4.5.1 Homogenisierungspuffer
- 2.4.5.2 Bradford-Reagenz
- 2.4.5.3 2x-SDS-Probenpuffer (Lämmli)
- 2.4.5.4 SDS-Polyacrylamid-Trenngel 15%
- 2.4.5.5 SDS-Polyacrylamid-Sammelgel 4,5%
- 2.4.5.6 Elektrophoresepuffer
- 2.4.5.7 Transferpuffer
- 2.4.5.8 PBS
- 2.4.5.9 Blockierpuffer
- 2.4.5.10 Antikörperpuffer
- 2.4.5.11 Waschpuffer
- 2.4.5.12 Lamin A-Antikörper
- 2.4.5.13 Calsequestrin-Antikörper
- 2.4.5.14 HRP-konjugierter Anti-Rabbit-IgG-Antikörper
- 2.4.5.15 ECL-Reagenz
- 2.5 Caspase 3/7-Assay
- 3 Ergebnisse
- 3.1 Validierung der verwendeten Methoden
- 3.1.1 Abhängigkeit der DNA-Fragmentierung von der Ischämiedauer
- 3.1.2 Positivproben für den Lamin A-Antikörper
- 3.1.3 Abhängigkeit der Caspase 3/7-Aktivität von der Ischämiedauer
- 3.2 Untersuchungen an der Ap-2α−/+-Linie
- 3.2.1 Apoptosenachweis durch DNA-Fragmentierung
- 3.2.2 Apoptosenachweis mittels Western Blot
- 3.2.3 Apoptosenachweis mittels Caspase 3/7-Aktivitätsmessung
- 3.3 Untersuchungen an der Crem−/−-Linie
- Abbildung 1: Abhängigkeit der DNA-Fragmentierung von der Länge der Ischämie- und Reperfusionsphase
- Abbildung 2: Abhängigkeit der DNA-Fragmentierung von der Länge der Ischämie- und Reperfusionsphase
- Abbildung 3: Kontrollen für den verwendeten Lamin A-Antikörper
- Abbildung 4: Caspase 3/7-Aktivität in Mäuseherzen abhängig von der Perfusions- und Ischämiedauer – gemessen als DEVD-Spaltung
- Abbildung 5: Ischämieempfindlichkeit bei Herzen von Ap-2α−/+-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Herzen – gemessen durch DNA-Fragmentierung
- Abbildung 6: Ischämieempfindlichkeit bei Herzen von Ap-2α−/+-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Herzen – gemessen durch DNA-Fragmentierung
- Abbildung 7: Ischämieempfindlichkeit bei Herzen von Ap-2α−/+-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Herzen – gemessen durch Lamin A-Spaltung
- Abbildung 8: Ischämieempfindlichkeit bei Herzen von Ap-2α−/+-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Herzen – gemessen durch Lamin A-Spaltung
- Abbildung 9: Ischämieempfindlichkeit bei Herzen von Ap-2α−/+-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Herzen – gemessen als DEVD-Spaltung durch Caspase 3/7
- Abbildung 10: Ischämieempfindlichkeit bei Herzen von Crem−/−-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Herzen – gemessen durch DNA-Fragmentierung
- Abbildung 11: Ischämieempfindlichkeit bei Herzen von Crem−/−-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Herzen – gemessen durch DNA-Fragmentierung
- Abbildung 12: Ischämieempfindlichkeit bei Herzen von Crem−/−-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Herzen – gemessen als DEVD-Spaltung durch Caspase 3/7
- 4 Diskussion
- 4.1 Hauptergebnisse der Arbeit
- 4.2 Methoden zur experimentellen Auslösung und Erfassung von Apoptose im adulten Herzen
- 4.3 Ergebnisse der Untersuchungen an heterozygoten Ap-2α−/+-Tieren
- 4.4 Ergebnisse der Untersuchungen an Crem-Knockouttieren
- 5 Zusammenfassung und Ausblick
- 6 Literaturverzeichnis
- 7 Abkürzungsverzeichnis
- 8 Danksagung
- 9 Lebenslauf