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Abstract (German)

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Aufarbeitungsmethode zur komponentenspezifischen Kohlenstoffisotopenmessung von Nortestosteron und dessen Precursor Dehydroepiandrosteron (DHEA) im Eberurin entwickelt.

Die Urinextrakte, die von Ebern mit einheitlicher Fütterung von C3-Pflanzen stammten, wurden underivatisiert mit kalter On Column Technik auf das GC/C/IRMS-System aufgegeben. Das erarbeitete Aufreinigungsverfahren lieferte genügend reine Extrakte, so dass zuverlässige δ13C-Werte von Nortestosteron und DHEA erhalten werden konnten.

Die Aufreinigungsschritte waren nach vorheriger Hydrolyse mit β-Glucuronidase aus dem Schneckenschleim der Helix pomatia eine Flüssig-/Füssigextraktion mit anschließender präparativer HPLC-Aufreinigung auf einer Normalphase für Nortestosteron und einer zusätzlichen reversed Phase für DHEA.

Die Nortestosteronkonzentration im Eberurin wurde mit einer Spanne von 34,8 µg/kg bis 1112,0 µg/kg (Median: 224,3 µg/kg) bestimmt, wobei der meiste Anteil ungebunden vorlag. Der Median des δ13C-Wertes von Nortestosteron lag bei -26,47 ‰.

Das Vorläufersteroid DHEA bei der Nortestosteronbiosynthese wurde mit einer Konzentration im Eberurin von 196,0 µg/kg bis 5184,0 µg/kg ermittelt. Der Median lag mit 556,0 µg/kg deutlich über der Konzentration von Nortestosteron, was durch den im Schwein dominierenden Delta 5-Biosyntheseweg erklärt werden kann. Der Median des δ13C-Wertes von DHEA lag bei -26,63 ‰.

Vergleicht man den gemessenen δ13C-Wert des Futters der Eber von -25,91 ‰ mit den gemessenenen 13C-Werten von Nortestosteron und DHEA, spiegelt sich die isotopische Kohlenstoffzusammensetzung des Futters in denen der Steroiden wieder.

Es konnten die Kohlenstoffisotopenverhältnisse einiger synthetischer Nortestosteronpräparate bestimmt werden.

Zusätzlich konnten im Eberurin die weiteren Steroide Norandrostendion, Testosteron, Epitestosteron, Etiocholanolon, 5-Androsten-3β,17β-diol, 5β-Androstan-3α,17β-diol, 11-Ketoetiocholanolon, Estren-5(10)-3α,17β-diol und das Eberpheromon 5α-Androst-16-en-3β-ol nachgewiesen werden.

Um mit der Methode der Stabilisotopen-Massenspektrometrie eine illegale Anwendung von Nortestosteron an Ebern nachweisen zu können, sind noch weitere Untersuchungen im Rahmen von Tierversuchen notwendig. Eber unbekannter Herkunft und unbekannter Fütterung müssen mit synthetischem Nortestosteron behandelt und die δ13C-Werte von Nortestosteron und DHEA oder eines anderen Vorläufers bestimmt werden. Zusätzlich müssen die δ13C-Werte der auf dem internationalen Markt befindlichen Nortestosteronpräparate bestimmt werden.

Abstract (English)

This thesis describes a clean-up procedure and analytical method for the compound-specific isotopic measurement of nortestosterone and its precursor dehydroepiandrosterone (DHEA) from urine of boars. The results were obtained with this method.

To investigate the influence of individual animals and to exlude the influence by the diet, a group of boars of different breed were fed with a standardised C3-plant diet. The boars' urine was firstly treated with β-glucuronidase from Helix pomatia to hydrolyse glucuronides of the steroids. The resulting solution was subjected to a liquid/liquid extraction and a normal-phase HPLC clean-up step to achieve a matrix-free nortestosterone peak. For DHEA it was necessary to apply an additional reversed-phase HPLC clean-up step. The cleaned extracts were injected without derivatization of the steroids by cold on column injection into the GC/C/IRMS system. The developed clean-up procedure provided a sufficiently clean extract for reliable nortestosterone and DHEA carbon isotope measurements with baseline separation of these analytes and also allowed to detect more steroids like norandrostendione, testosterone, epitestosterone, etiocholanolone, 5-androsten-3β,17β-diol, 5β-androstan-3α,17β-diol, 11-ketoetiocholanolon, estren-5(10)-3α,17β-diol and 5α-androst-16-en-3β-ol. The extracts were also used for quantitative measurements by GC/FID. It could be shown that the major part of nortestosterone in the boars' urine was unconjugated, while DHEA was found exclusively as glucuronide.

The concentration of nortestosterone in the boars' urine had values between 34.8 µg/kg and 1112 µg/kg. The median was 224.3 µg/kg and the median of the δ13C value of nortestosterone was -26.47 ‰. The concentration of DHEA, which originates from the delta 4-pathway of swines, was between 196 µg/kg and 5184 µg/kg with a median of 556.0 µg/kg. The median of the δ13C value of DHEA was -26.63 ‰. Both, the δ13C values of nortestosterone and of DHEA reflect the isotopic composition of the boars' feed, which had a δ13C value of -25.9 ‰.

Seven different commercially available synthetic nortestosterone standards or preparations had δ13C values between -29.65 ‰ and -29.13 ‰. Just one (-27.28) was in the range of natural testosterone of boars' urine between -27.53 ‰ and -24.14 ‰. However, it still needs a higher degree of analytical validation and further animal experiments with applying synthetic nortestosterone and different diets before an illicit application of nortestosterone to boars can be reliably detected.

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