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Abstract (German)

In dieser Arbeit wurde ein Screening-Test mit einem Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Biosensor (SPR Biosensor) entwickelt, um ß-Lactam-Antibiotika-Rückstände in Milch nachzuweisen. Als biomolekulare Erkennungspartner für Penicilline und Cephalosporine wurden Penicillin-bindende Proteine (PBP) eingesetzt. PBP sind das Target der ß-Lactam-Antibiotika im bakteriellen Stoffwechsel. Sie binden spezifisch Penicilline und andere ß-Lactam-Antibiotika, wobei die ß-Lactam-Antibiotika kovalent an das aktive Zentrum der PBP binden und PBP/ß-Lactam-Konjugate entstehen. Der Screening-Test basiert auf der Bindung eines Markermolekül-markierten Ampicillin-Derivates an ein PBP. Die PBP/Ampicillin-Konjugate werden durch eine SPR-Biosensor-Analyse mit Markermolekül-spezifischen Antikörpern nachgewiesen.

Verschiedene PBP, markierte Ampicillin-Derivate und Markermolekül-spezifische Antikörper wurden untersucht, um ß-Lactam-Antibiotika-Rückstände im Konzentrationsbereich der innerhalb der EU festgelegten Rückstandshöchstmengen (MRL Werte) nachzuweisen. PBP wurden zum einem aus den solubilisierten Membranproteinen von Streptococcus thermophilus und Bacillus stearothermophilus mittels Ampicillin-Affinitätschromatographie isoliert. Zum anderen wurde ein lösliches PBP 2x-Derivat aus Streptococcus pneumoniae (PBP 2x*) als rekombinantes Protein in Escherichia coli überexpremiert. Aufgrund der höheren Affinitäten gegenüber ß-Lactam-Antibiotika wurde das PBP 2x* als biomolekularer Erkennungspartner für die SPR-Biosensor-Analysen eingesetzt.

Ampicillin (AMPI) wurde mit Digoxigenin- (DIG), 2,4 Dinitrophenyl- (DNP) und Fluorescein-Derivaten (FLU) markiert. Als Markermolekül-spezifische Antikörper wurden verschiedene polyklonale und monoklonale DIG- , DNP- und FLU-spezifische Antikörper untersucht. Von den PBP 2x*/Ampicillin-Konjugaten konnte durch die SPR-Biosensor-Analyse nur das PBP 2x*-Konjugat mit DIG-markiertem Ampicillin (DIG AMPI) und einem monoklonalen DIG-spezifischen Antikörper mit ausreichender Sensitivität und Reproduzierbarkeit bestimmt werden.

Benzylpenicillin, Ampicillin, Amoxicillin, Cloxacillin, Cephalexin und Cefoperazon konnten mit diesen Reagenzien (PBP 2x*, DIG-AMPI und monoklonaler DIG-spezifischer Antikörper) in entfetteter Vollmilch und Rohmilch unterhalb der für diese ß- Lactam-Antibiotika festgesetzten Rückstandshöchstmengen nachgewiesen werden. Die Analyse von individuellen Rohmilch-Proben von 20 Kühen bestätigte die Erfahrung, dass die unspezifische Bindung von Matrix-Komponenten an den Sensor-Chip ein kritischer Faktor ist, der die Nachweisgrenze eines SPR-Biosensor-Assays erhöhen kann. Die Matrixinterferenzen konnten durch eine Hitze-Behandlung und die Zugabe von Carboxymethyldextran zu den analysierenden Proben auf ein konstantes und niedriges Niveau reduziert werden. Mit dieser Probenvorbereitung konnte Benzylpenicillin auch in den individuellen Rohmilch-Proben an der festgesetzten Rückstandshöchstmenge nachgewiesen werden.

Abstract (English)

A biospecific interaction assay (BIA) for the detection of residues of ß-lactam antibiotics in milk was developed using a surface plasmon resonance (SPR) biosensor. Penicillin-binding proteins (PBP), which are enzymes involved in the final stages of murein biosynthesis and represent the lethal target of ß-lactam antibiotics, were used as biomolecular recognition partners for penicillins and cephalosporins.

PBP were mixed with samples, incubated and then labelled with an antigen-tagged ampicillin-derivative prior to SPR analysis with antibodies against the antigen-tag immobilised on the sensor chip. In order to detect residues of ß-lactam antibiotics at concentrations corresponding to maximum residue limits (MRL) set by the European Union, a suitable PBP, an antigen-tagged ampicillin-derivative and an antibody against the antigen had to be found. PBP of Streptococcus thermophilus and Bacillus stearothermophilus were partly purified by ampicillin affinity chromatography and a soluble derivative of PBP 2x of Streptococcus pneumoniae was expressed as a recombinant protein in Escherichia coli. This soluble PBP 2x-derivative, called PBP 2x*, had higher affinities towards different ß-lactam antibiotics than the other studied PBP and was chosen for construction of the ß-lactam-specific BIA.

Ampicillin (AMPI) was labelled with derivatives of digoxigenin (DIG), fluorescein (FLU) or 2,4 dinitrophenol (DNP). DIG, FLU and DNP were coupled through their activated N-hydroxysuccinimide esters to the amino group of AMPI, yielding DIG labelled AMPI (DIG AMPI), FLU labelled AMPI (FLU-AMPI) and DNP labelled AMPI (DNP-AMPI), respectively. DIG AMPI, FLU-AMPI and DNP AMPI were examined as antigen-tagged ampicillin-derivatives.

Benzylpenicillin, ampicillin, amoxicillin, cloxacillin, cephalexin and cefoperazone could be detected in commingled raw milk at concentrations below their respective MRL using PBP 2x*, DIG-AMPI and the monoclonal antibody against DIG for SPR analysis of milk samples. The SPR analysis of 20 raw milk samples from individual cows confirmed that matrix interferences are a critical point in BIAs as non-specific binding of matrix components to the sensor chip elevated the detection limit dramatically. Matrix interferences could be reduced to a lower and a more constant level by a heat treatment step and the addition of carboxymethylated dextran to the samples. With this additional sample preparation, individual samples containing benzylpenicillin at the MRL were identified as positive.

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