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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Dissertation befaßt sich hauptsächlich mit der Aufklärung der Genetik und der postulierten Biosynthesewege der 2DOS- und verwandten Aminocyclitol-Aminoglykosid-Antibiotika (ACAGAs).

Folgende Ergebnisse konnten mittels der beschriebenen Vorgehensweisen erzielt werden:

1) Durch die Konstruktion homologer und heterologer Sonden (Primer) konnten aus den entsprechenden Cosmidbänken positiv hybridisierende Cosmide identifiziert werden. Die anschließenden Analysen (Restriktion, PCR, Cosmidkarte) wurde durchgeführt um die Cosmide für die Sequenzierung auszuwählen, die ACAGAs-Gencluster (oder Teile davon) enthielten;

2) Die Insertsequenzen einzelner bzw. überlappender Cosmid-Klone wurde sequenziert, analysiert, und bei der EMBL Genbank eingereicht;

3) Die Biosynthese-Gencluster für Neomycin, Ribostamycin, Paromomycin, Lividomycin, Kanamycin, Tobramycin, Gentamicin, Fortimicin, Istamycin, Apramycin und Hygromycin B wurden analysiert und vollständig sequenziert. Das Butirosin-Gencluster konnte nur teilweise charakterisiert werden;

4) Weiterführende Aussagen über einen allgemeinen Biosyntheseweg für die entsprechenden ACAGAs konnten getroffen werden;

5) Ein Charakteristikum der gen-, kan- und tob-Cluster ist, daß einige der zentral wichtigen Gene, ebenfalls konserviert in anderen ACAGAs Genclustern sind, in der Vergangenheit dupliziert oder sogar multipliziert wurden, und so neue biosynthetische Funktionen erworben wurden. Interessanterweise, ergab die Analyse der for-, gen- und kan-Cluster hohe Evidenz dafür, daß die Gentamicine Produkte sind, die aus einem Hybrid der Kanamycin/Fortimicin Biosynthesewege entstanden sind.

6) Es wurden verschiedene heterologe Primer entwickelt um Biosynthesegene aus unterschiedlichen ACAGA produzierenden Stämmen zu detektieren und ihre Anwendbarkeit getestet;

7) Aus dem Kanamycin Biosynthese-Gencluster wurden die drei Gene kanC, kanS1 und kanE ausgewählt, um die Genprodukte biochemisch zu charakterisieren. Um dies zu erreichen wurden die drei Gene kloniert und in E. coli und/oder S. lividans TK23 expremiert. Die entsprechenden Enzymaktivitäten wurden mit DC, HPLC und spektrophotometrischen Analysen belegt;

8) kanC codiert für eine 2-Desoxy-scyllo-Inosose Synthase, kanS1 für eine 2-Desoxy-scyllo-Inosose Aminotransferase, sowie für eine 1-keto-2,3-Desoxy-3-Amino-scyllo-Inositol- Aminotransferase (bifunktionelles Enzym) und kanE für eine 2-Desoxy-scyllo-Inosamine-1-Dehydrogenase (in Anwesenheit von Zn++ Ionen und NAD).

Zusammenfassung (Englisch)

This dissertation focuses mainly on the elucidation of the genetics and the proposed pathways for the production of 2DOS-containing and related aminocyclitol aminoglycoside antibiotics (ACAGAs). The following results using different strategies had been achieved:

1) Homologous and heterologous probes were constructed for screening the cosmid banks and the positively hybridized cosmids were identified. Analysis of the respective cosmids (restriction analysis, PCR, cosmid mapping) was carried out to select one or more cosmids harboring the ACAGAs biosynthetic gene clusters (or part thereof) for sequencing;

2) The insert sequences of a single or of overlapping cosmid clones were determined, analysed, sequenced and submitted to the EMBL gene bank and received the accession codes;

3) The biosynthetic gene clusters for NM, RM, PM, LM, KM, TM, GM, FTM, IM, Apr and HM-B have been fully sequenced and analyzed except the one for BU which was still incomplete;

4) Further proposals of a general pathway design for the biosynthesis of the respective ACAGAs was made;

5) A characteristic feature of the gen-, kan- and tob-clusters is that some of the centrally important genes, also conserved in the other ACAGAs gene clusters had been duplicated or even multiplied in the past, most probably in order to acquire new biosynthetic functions. Interestingly, analysis of the for-, gen- and kan-clusters gave a good evidence that GMs are products formed via a hybrid of KM/FTM pathway;

6) Newly developed heterologous primers have been designed and tested for their efficiency via detection of various homologous biosynthetic genes in different ACAGAs producing strains;

7) The three kanC, kanS1 and kanE genes were selected from the KM biosynthetic gene cluster for biochemical characterization of their encoded proteins. In order to achieve this goal, the three genes were cloned, heterologous expressed in E. coli and/or S. lividans TK23 followed by biochemical analysis of the expressed proteins. TLC, HPLC and spectrophotometric assays were the tools used for testing the respective enzyme activities;

8) Results showed that kanC encodes a 2-deoxy-scyllo-inosose synthase, kanS1 encodes a 2-deoxy-scyllo-inosose aminotransferase as well as, 1-keto-2,3-deoxy-3-amino-scyllo inositol aminotransferase [bifunctional enzyme] and kanE was high likely to encode a 2-deoxy-scyllo-inosamine 1-dehydrogenase (in the presence of Zn++ ion and NAD).

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