Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung der Lin A-Biosyntheseenzyme LmbC und LmbN, die als mögliche Komponenten des Multienzymkomplexes der „NDLSynthestase“ postuliert wurden.
• Die vermutliche Beteiligung von LmbC an der Biosynthese wurde zunächst anhand der lmbC-Knock-out-Mutante nachgewiesen. Die Mutante zeigte den Lin A⁻-Phänotyp, der durch trans-Komplementation aufgehoben werden konnte. Im Anschluss konnte das heterolog in E. coli überproduzierte, lösliche His-tag-LmbC in der Funktion als PPLAdenylat-bildendes Enzym bestätigt und sein Substratspektrum charakterisiert werden. Dabei wurde auch der Nachweis erbracht, dass PPL das natürliche Substrat von LmbC ist und das Strukturelement des Pyrrolidinrings die Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche Adenylylierung darstellt.
• Im Verlauf dieser Arbeit wurde bei Aminosäuresequenz-Analysen am N-Terminus des ursprünglich als LmbN identifizierten Genprodukts die Konsensussequenz einer 4‘-Phosphopantethein-Bindestelle eines Carrierproteins des Dcp-Typs lokalisiert. Daraufhin wurde durch erneute Sequenzierung bewiesen, dass es sich bei LmbN tatsächlich um eine Fusion zweier funktionsfremder Enzyme handelte, was zusätzlich durch Untersuchungen der heterologen Expressionsprodukte abgesichert werden konnte.
• Sowohl LmbN als auch ein Polypeptid bestehend aus den ersten 79 Aminosäuren des N-Terminus (LmbPCP) wurden als His-tag-Fusionsproteine überproduziert und angereichert, um die Funktion als Carrierenzym innerhalb der Biosynthese zu bestätigen. Zuerst wurde zu diesem Zweck versucht, die Carrierprotein-Domäne in vitro posttranslational mit der prosthetischen Gruppe 4‘-Phosphopantethein aus Coenzym A zu modifizieren. Für das LmbPCP-Protein war dies teilweise mit der Phosphopantethein-Transferase AcpS (PPTase aus B. subtilis) gelungen. Jedoch konnte für das Gesamtprotein LmbN weder mit AcpS noch mit Sfp (PPTase aus B. subtilis) eine Phosphopantheteinylylierung nachgewiesen werden. Bei den anschließenden Versuchen, LmbN bzw. LmbPCP mit der durch LmbC aktivierten Aminosüure [3H]-PPL zu beladen, konnte keine kovalente Bindung zwischen den Peptiden und dem Substrat gezeigt werden.
• Eine Beteiligung von LmbN an der Lin A-Biosynthese konnte nur mit Hilfe einer lmbN-Deletionsmutante eindeutig bewiesen werden. In der Mutante ließ sich der Wildtyp-Phänotyp in trans sowohl durch das verkürzte Gen lmbPCP als auch durch das komplette Gen lmbN wiederherstellen.