Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung der Lin A-Biosyntheseenzyme LmbC und LmbN, die als mögliche Komponenten des Multienzymkomplexes der „NDLSynthestase“ postuliert wurden.

• Die vermutliche Beteiligung von LmbC an der Biosynthese wurde zunächst anhand der lmbC-Knock-out-Mutante nachgewiesen. Die Mutante zeigte den Lin A⁻-Phänotyp, der durch trans-Komplementation aufgehoben werden konnte. Im Anschluss konnte das heterolog in E. coli überproduzierte, lösliche His-tag-LmbC in der Funktion als PPLAdenylat-bildendes Enzym bestätigt und sein Substratspektrum charakterisiert werden. Dabei wurde auch der Nachweis erbracht, dass PPL das natürliche Substrat von LmbC ist und das Strukturelement des Pyrrolidinrings die Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche Adenylylierung darstellt.

• Im Verlauf dieser Arbeit wurde bei Aminosäuresequenz-Analysen am N-Terminus des ursprünglich als LmbN identifizierten Genprodukts die Konsensussequenz einer 4‘-Phosphopantethein-Bindestelle eines Carrierproteins des Dcp-Typs lokalisiert. Daraufhin wurde durch erneute Sequenzierung bewiesen, dass es sich bei LmbN tatsächlich um eine Fusion zweier funktionsfremder Enzyme handelte, was zusätzlich durch Untersuchungen der heterologen Expressionsprodukte abgesichert werden konnte.

• Sowohl LmbN als auch ein Polypeptid bestehend aus den ersten 79 Aminosäuren des N-Terminus (LmbPCP) wurden als His-tag-Fusionsproteine überproduziert und angereichert, um die Funktion als Carrierenzym innerhalb der Biosynthese zu bestätigen. Zuerst wurde zu diesem Zweck versucht, die Carrierprotein-Domäne in vitro posttranslational mit der prosthetischen Gruppe 4‘-Phosphopantethein aus Coenzym A zu modifizieren. Für das LmbPCP-Protein war dies teilweise mit der Phosphopantethein-Transferase AcpS (PPTase aus B. subtilis) gelungen. Jedoch konnte für das Gesamtprotein LmbN weder mit AcpS noch mit Sfp (PPTase aus B. subtilis) eine Phosphopantheteinylylierung nachgewiesen werden. Bei den anschließenden Versuchen, LmbN bzw. LmbPCP mit der durch LmbC aktivierten Aminosüure [3H]-PPL zu beladen, konnte keine kovalente Bindung zwischen den Peptiden und dem Substrat gezeigt werden.

• Eine Beteiligung von LmbN an der Lin A-Biosynthese konnte nur mit Hilfe einer lmbN-Deletionsmutante eindeutig bewiesen werden. In der Mutante ließ sich der Wildtyp-Phänotyp in trans sowohl durch das verkürzte Gen lmbPCP als auch durch das komplette Gen lmbN wiederherstellen.

This work on the Lin A-Biosynthesis set out to elucidate the enzymatic function of the enzymes LmbC and LmbN. Both polypeptides were proposed components of the „NDLsynthetase“, that was supposedly a multi enzyme complex.

• The essential participation of LmbC in the Lin A-biosynthesis was initially proven by an lmbC knock-out mutant. The mutant showed the expected Lin A⁻-phenotype that was readily complemented by plasmid encoded lmbC to regain the wild type phenotype. The heterologously overproduced His-tag-LmbC (E. coli) was confirmed in its presumed function as a PPL-adenylate forming enzyme and its substrate specificity was characterized. Moreover, the results implied PPL being the natural substrate of LmbC, and the structural element of the pyrrolidine ring system were fundamental for fitting the substrate binding pocket of the enzyme.

• In the course of this work the consensus sequence of a 4’-phosphopantetheine binding site characteristic for carrier proteins of the Dcp-type was identified at the N-terminal end of LmbN. By once again sequencing the lmbN reading frame it was determined that LmbN is a fusion of functionally independent enzymes and not resulting from sequence inaccuracies. This was confirmed by analyzing the product of the heterologous expression of lmbN in S. lividans.

• The protein LmbN as well as a polypeptide consisting of the 79 amino acids from the N-terminal end (LmbPCP) were overproduced as His-tag fusions. It was tested wether the carrier protein domains of both polypeptide chains could be posttranslationally modified with the prosthetic group 4’-phosphopantetheine. The LmbPCP protein was partially modified by the phosphopantetheine transferase AcpS (PPTase from B. subtilis), however, in assays with LmbN phosphopantetheinylation was neither observed with AcpS nor with Sfp (PPTase from B. subtilis). Finally, in experiments to load activated [3H]-PPL onto LmbN or LmbPCP no covalent binding between the carrier domains and the substrate were observed.

• The participation of LmbN in the biosynthesis of Lin A was merely proven by the Lin A⁻-phenotyp of a deletion mutant in lmbN that was complemented by plasmid encoded lmbN as well as by the shortend gene lmbPCP.