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Abstract (German)

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse der Gene lmbB1, lmbB2 und lmbY, die Teile des Lincomycin A-Biosyntheseclusters von Streptomyces lincolnensis darstellen und deren Genprodukte an der Herstellung der Propylprolin (PPL)-Untereinheit beteiligt sind. Wenn die Gene lmbB1B2 gemeinsam in Escherichia coli überexprimiert wurden, dann setzten diese Zellen spezifisch L-Tyrosin und L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) zu einem gelb gefärbten Produkt um. Das alleine produzierte LmbB1-Protein katalysierte die Umwandlung von L-DOPA, aber nicht von L-Tyrosin. Das gereinigte LmbB1-Protein zeigte einen KM-Wert für L-DOPA von 258 µM. Die L-Tyrosin-umsetzende Aktivität konnte nur in vivo nachgewiesen werden und war von LmbB2 abhängig. Die Daten ließen den Schluß zu, daß LmbB1 eine spezifische extradiol-spaltende L-DOPA-2,3-Dioxygenase ist und LmbB2 eine L-Tyrosin-3-Hydroxylase repräsentiert. Das labile Produkt der Ringspaltung durch LmbB1 konnte weder mit Ammoniak abgefangen noch gereinigt werden. Es wird daher spekuliert, daß es eine heterozyklische Struktur besitzt. Das LmbY-Protein wies 24 - 29 %ige As-Sequenzidentität zu verschiedenen F420-abhängigen Reduktasen auf. Bei der Hybridisierung eines lmbY Fragmentes mit der chromosomalen DNA verschiedener Streptomyces-Stämme wurden eindeutige Signale bei allen Lincomycin-Produzenten erhalten, deren Muster sich in vier Gruppen einteilen ließen. Es wurden Knock-out-Mutanten des Gens lmbY in S. lincolnensis NRRL 2936 hergestellt, die einen Lincomycin–-Phänotyp zeigten. Die Mutanten ließen sich durch Fütterung mit PPL und nur durch die vollständige Transkriptionseinheit (Operon) lmbUYX in trans komplementieren. Durch Promotorprobe-Versuche wurde im Bereich zwischen -286 und -113 bp vor lmbU die Anwesenheit eines schwachen Promotors entdeckt. Die heterologe Expression von lmbY in S. lividans unter der Kontrolle des ermEp lieferte lösliches Protein. Die mit Poly-Histidin fusionierte Version des Enzyms wurde zu 96 - 98 % gereinigt. Die in S. lincolnensis gemessene NADPH:F420-Reduktase-Aktivität konnte in allen Mutanten mit zerstörtem lmbY (und/oder lmbX) noch nachgewiesen werden. Dadurch wurde diese Funktion für LmbY ausgeschlossen. Die verschiedenen Anhäufungsprodukte der hergestellten Mutanten konnten durch Fütterung von L-[U-14C]Tyrosin dünnschichtchromatographisch dargestellt werden und deren Rf-Werte bestimmt werden. Es gelang jedoch nicht, genügend Zwischenprodukt für einen Umsatz mit LmbY zu gewinnen. Zusammenfassend ist LmbY, wahrscheinlich auch LmbX, als eindeutig an der PPL-Biosynthese beteiligt einzuordnen.

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