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Abstract (German)

β-Glucane aus Basidiomycetes und Ascomycetes sind bekannt für ihre Wirkung als "Biological Response Modifier". Aktuell angewandte Extraktionsmethoden führen zu einer partiellen Degradation der nativen Struktur. Ein alternativer Extraktionsprozess für diese Glucane ist deswegen von besonderem Interesse. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine enzymatische Extraktionsmethode entwickelt. Dabei konnte ein Prozess realisiert werden, der in Kombination von enzymatischen und milden alkalischen Extraktionsschritten, β-Glucane aus dem Zellmaterial zu isolieren gestattet. Hierbei erfolgt die schrittweise Extraktion durch Inkubation mit Chitinase und β-Glucanase, jeweils gefolgt von einer milden Extraktion mit verdünnter Natronlauge. Durch eine speziell entwickelte Bestim-mungsmethode für Chitin konnte die eingesetzte Substratmenge für die Chitinase genau kontrolliert und gesteuert werden.

Zum jetzigen Zeitpunkt ist die enzymatische Extraktion von Glucanen nur aus wenigen ausgewählten Mycelien möglich. Aus Fruchtkörpern konnten mit dieser Methode keine Glucane isoliert werden. Allerdings besitzen Mycelien aufgrund ihres schnellen Wachstums ein großes Potential als Ressource für β-Glucane, da sie einfacher als die jeweiligen Fruchtkörper kultiviert werden können. Die entwickelte enzymatische Methode wurde mit einer in der Literatur beschriebenen Extraktionsmethode hinsichtlich ihrer Ausbeuten und der Struktur der erhaltenen Glucanprodukte verglichen. Dies ermöglicht eine genaue Beur-teilung, ob die neue Extraktionsmethode ähnlich effektiv ist.

Mit Hilfe der in dieser Arbeit speziell entwickelten bzw. optimierten analytischen Bestimmungsmethoden konnten die Ausbeuten an Gesamt-β-Glucanen und der Anteil der wichtigen triplehelicalen Glucane ermittelt werden. Es konnten für die enzymatische Extraktionsmethode Gesamt-β-Glucanausbeuten in Höhe von 1,4-3,5 g/100 g Trockenmasse bestimmt werden. Der Anteil an Glucanen mit einer Triplehelix liegt bei 13-43% des Gesamt-β-Glucangehaltes. Im Vergleich sind die erzielten Ausbeuten etwas geringer als bei der Literaturmethode, wo Ausbeuten von 2,5-6,8 g/100 g Trockenmasse erzielt wurden. In Verbindung mit den bestimmten Wachstumsraten kann zusätzlich die Nutzungsmöglichkeit verschiedener Mycelien als Ressource zur β-Glucangewinnung abgeschätzt werden. Hier scheinen besonders Trametes versicolor, Pleurotus pulmonarius und Hypsizygus tessulatus großes Potential zu besitzen.

Mit Hilfe der durchgeführten strukturanalytischen Bestimmungen (NMR, Bestimmung der Monosaccharidzusammensetzung und GPC) konnten die durch die enzymatische Extraktion isolierten typischen β-1,3-1,6-verknüpften Glucane identifiziert werden. Darüber hinaus wurden verschiedene weitere α- und β-glykosidische Bindungen charakterisiert. Neben dem Hauptmonosaccharid Glucose konnten in größeren Mengen Galactose, Mannose und in Spuren Fucose, Ribose, Rhamnose, Arabinose und Xylose als Bausteine der Glucane identifiziert werden. Die gewichtsmittleren Molekularmassen der enzymatisch isolierten Glucane liegen zwischen 87-111 kDa. Vergleichende Untersuchungen der Glucane, die mit der Literaturmethode extrahiert wurden, haben gezeigt, dass im Rahmen der dort angewandten Extraktionsschritte eine strukturelle Degradation abläuft. Durch den ersten Extraktionsschritt der Literaturmethode, einer Inkubation mit Kalilauge, konnten strukturell den enzymatisch extrahierten Glucanen ähnliche Produkte isoliert werden. Offensichtlich werden Seitenketten bei dem darauf folgenden sauren Extraktionsschritt hydrolisiert. Die durch die enzymatische Extraktion gewonnenen Glucane sind somit eine sehr gute Alternative zu den herkömmlich gewonnenen Glucanen.

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die für diese Arbeit formulierten Ziele mit der Entwicklung einer schonenden enzymatischen Extraktionsmethode realisiert werden konnten.

Abstract (English)

Mushroom β-glucans are known for their activity as "biological response modifiers" and anticarcinogenic agents. β-1,3-1,6 branched glucans with a triple helix as their tertiary structure are the most potent glucans. Current methods for the extraction of these polysaccharides are based on a combination of alkaline and acid treatment under high temperature conditions. This treatment leads to a partial degradation and denaturation of the primary and tertiary structure of the glucans. In the present work a new enzymatic extraction method for β-glucans was developed. It is based on various enzymatic extractions with chitinase, β-glucanase and furthermore with mild alkaline extractions. Primarily, this method was developed for the extraction of mushroom mycelia. The use of the fast growing mushroom mycelia as a resource for glucan isolation is newish and seems to be efficient. Until now, glucans were mainly isolated from the mushroom fruiting bodies. The growth kinetics from different mycelia show that especially species like Trametes versicolor, Pleurotus pulmonarius and Hypsizygus tessulatus have great potential as a fast growing resource for β-glucans.

Furthermore, it was of interest to quantify the chitin content in the various mushrooms and especially in the mycels. Therefore, a new method for the quantification of this cell substance was developed. With a specific method for chitin extraction and determination the ratio of chitin and chitinase could accurately be detected.

For further evaluation, the new enzymatic extraction was compared to the method of Sietsma and Wessels (1977). This method is a common process to isolate β-glucans. Therefore, the comparison of the glucan yields and glucan structures is essential to validate the new enzymatic extraction method. With two new and optimized quantification methods the yields of the total-β-glucans and the glucans with a triple helix tertiary structure were determined. The results showed that 1.4-3.5 g total-β-glucans per 100 g dry mass could be isolated from the mushroom mycelia by the new enzymatic method. The amount of triple helical glucans was 13-43%. The yield of total-β-glucans isolated with the method of Sietsma and Wessels (1977) was a little bit higher (2.5-6.8 g/100 g).

The structural analysis with GPC, GC and NMR of the enzymatic isolated glucans revealed the typical β-1,3-1,6-glycosidic linkages. However, other α- and β-glykosidic linkages were determined, too. The main monosaccharide was glucose, followed by galactose, mannose and traces of fucose, ribose, rhamnose, arabinose und xylose. The average molecular mass was 87-111 kDa. In contrary, the structural analysis of the glucans isolated by the method of Sietsma and Wessels (1977) showed that a structural degradation occurs during the extraction process.

The method of Sietsma and Wessels (1977) is based on a combination of isolation steps with potassium hydroxide, chloric acid and sodium hydroxide. Especially the heat extraction of the cell walls with chloric acid and sodium hydroxide leads to a hydrolysis of polysaccharide side chains. This hydrolysation may affect the medical potential of the glucans.

But this hydrolysis was not observed, when using the new enzymatic extraction method. Thus, the glucans were isolated under preservation of their structure with a potential positive effect on their therapeutic activity.

All results of these experiments give essential support for the effective isolation of glucans based on the new enzymatic extraction method. This may have impact on the various applications of glucans.

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