Trabszo, Christof: Funktionelle Studien zur Arylsulfatase K (Arsk) anhand eines Arsk-defizienten Mausmodells. 2018
Inhalt
- Einleitung
- Zielsetzung der Arbeit
- Material
- Laborausstattung
- Verbrauchsmaterialien
- Chemikalien
- Saccharide
- Enzyme
- Kits
- Antikörper
- Plasmide
- Primer
- Zelllinien
- Puffer und Lösungen
- DNA- und Protein-Größenstandard
- Software & Online-Datenbanken
- Methoden
- Zellbiologische Methoden
- Kultivierung von eukaryotischen Zellen
- Kryokonservierung von Zellen
- Auftauen und Revitalisieren von Zellen
- Zellzahl-Bestimmung
- Zelllyse durch Ultraschallbehandlung
- Trypsinierung von Zellen
- Transfektion von Säugerzellen mittels Polyethylenimin
- Isolierung von Zellklonen nach stabiler Transfektion
- Histochemische Methoden
- Anfertigung von Kryo- und free-floating-Schnitten
- Alcian-Blau Färbung von Gewebeschnitten
- Immunfluoreszenz an Gewebeschnitten
- Aktive Perfusion mit Paraformaldehyd
- Passive Perfusion mit Paraformaldehyd
- Nachweis der lacZ-Insertionskassette
- Vermeidung von Autofluoreszenz (quenching)
- Filipin-Färbung von unverestertem Cholesterin
- Dreipunkt-Biegetest von Knochen
- Molekularbiologische-Methoden
- Primer-Design
- Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- Mutagenese-PCR
- Kolonie-PCR
- Quantitative PCR
- Agarose-Gelelektrophorese
- Analyse von DNA-Fragmenten nach Restriktionsverdau
- Aufreinigung von DNA aus Agarose-Gelen
- Mini/Midi-Präparation von Plasmid-DNA
- Sequenzierung von DNA
- Ligation von Plasmid-DNA und DNA-Fragmenten
- Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten
- RNA-Präparation aus Mausgeweben
- cDNA Synthese
- Isolierung genomischer DNA aus Mausgewebe
- Konzentrationsbestimmung von DNA
- Genotypisierung von Arsk-KO-Tieren
- Arbeiten mit Escherichia coli
- Präparation chemokompetenter Escherichia coli
- Transformation chemokompetenter Escherichia coli
- Anlegen von Kryokulturen in Glycerol
- Biochemische Methoden
- Herstellung von Gewebe- und Zellhomogenaten
- Proteinbestimmung mit dem BioRad-DC-Protein-Assay
- SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
- Western-Blot-Analyse (semi-dry)
- Ponceau-S Färbung von Membranen
- Strippen der PVDF-Membran
- Färbung von Polyacrylamid-Gelen mit Coomassie
- Färbung von Polyacrylamid-Gelen durch Silberlösung
- Aktivitätsbestimmung lysosomaler Standardenzyme
- Sulfataseaktivität gegenüber Pseudosubstraten
- Tritosomen-Präparation
- Ammoniumsulfat-Fällung
- Aufreinigung von His-markierter ARSK aus Zellkulturüberständen
- Glycobiologische Methoden
- Ergebnisse
- Generierung und Verifizierung der Arsk-KO-Maus
- Generierung der Arsk-KO-Maus
- Arsk-Expressionsmuster durch das lacZ-Reportergen
- Arsk-KO-Nachweis auf Proteinebene
- Makroskopische Befunde des Arsk-Mausmodells
- Einfluss des Arsk-KOs auf die Transkription anderer lysosomaler Gene
- Phänotypische Analyse des Arsk-Mausmodells
- Einfluss des Arsk-KOs auf viszeraler Organe
- Neuronales System der Arsk-KO-Tiere
- Sekundäre Speicherung
- Verhaltenstests
- Retina-Analyse in Arsk-KO-Mäusen
- Ossifikation
- Produktion und Aufreinigung humaner Arylsulfatase K
- Glykosaminoglykan-Speicherung
- Alcianblau-Färbung an Gewebeschnitten
- DMMB-basierte Bestimmung der GAG-Speichermenge in Geweben
- DMMB-basierte Bestimmung der GAG-Ausscheidung im Urin
- GAG-Analyse über massenspektrometrische Verfahren
- GRIL-LC/MS-Analyse der nicht-reduzierenden Enden (NREs) in GAGs
- Enzymatischer Umsatz des Speichermaterials mit rekombinanter humaner ARSK
- AMAC-basierte Zuckeranalyse
- Diskussion
- Charakterisierung des Arsk-Mausmodells
- Generierung und Validierung des Arsk-KOs
- Phänotypische Analyse des Arsk-Mausmodells
- Einfluss der Arsk-Expression auf die Regulation anderer lysosomaler Enzyme
- Neuropathologie, visuelles System und Verhalten der Arsk-Maus
- Einfluss der Arylsulfatase K-Defizienz auf die Ossifikation
- Speicherpathologie in der Arsk-Maus
- Produktion und Aufreinigung rekombinanter humaner Arylsulfatase K
- Glykosaminoglykan-Speicherung im Arsk-Mausmodell
- DMMB-basierte GAG-Analyse
- Massenspektrometrische Analyse der GAG-Speicherung
- Analyse des nicht-reduzierenden Endes von GAGs im Arsk-Mausmodell
- AMAC-basierter Arsk-Aktivitätsassay
- Generierung von 2-O-Sulfatierungen an GAGs
- Einordnung des Arsk-Mausmodells im Vergleich zu anderen Sulfatase-defizienten Mausmodellen
- Ausblick
- Appendix