Pfeifer-Sancar, Katharina: Entwicklung der Transkriptomsequenzierung und Anwendung zur Analyse des Transkriptoms von Corynebacterium glutamicum. 2014
Inhalt
- I Zusammenfassung der Arbeit
- II Einleitung
- 1 Das Bakterium Corynebacterium glutamicum
- 1.1 Taxonomie und Charakteristika der Gattung Corynebacterium
- 1.2 Entdeckung und wirtschaftliche Bedeutung von Corynebacterium glutamicum
- 1.3 Annotation sowie aktuelle Version des Genoms von Corynebacterium glutamicum
- 2 Die Transkriptionsmechanismen in Prokaryoten
- 2.1 Struktur und Aufbau der DNA-abhängigen RNA-Polymerase
- 2.2 Transkriptionsinitiation, -elongation und deren Regulation
- 2.3 Transkriptionstermination
- 3 Methoden der Transkriptomanalyse
- 3.1 Prinzipien der Transkriptom-Hochdurchsatz-Sequenzierung
- 3.2 Genomweite Transkriptomanalyse mittels RNAseq
- 4 Zielsetzung der Arbeit
- III Materialien und Methoden
- 1 Verwendete Materialien und Geräte
- 1.1 Bakterienstamm
- 1.2 Nährmedien
- 1.3 Oligonukleotide
- 1.4 Labor-Verbrauchsmaterialien, Enzyme und Kits
- 1.5 Chemikalien
- 1.6 Geräte
- 1.7 Software
- 1.8 Puffer und Lösungen
- 2 Mikrobiologische Methoden
- 2.1 Kultivierung von C. glutamicum
- 2.2 Lagerung von C. glutamicum
- 2.3 Bestimmung des Bakterientiters
- 2.4 Anzucht von C. glutamicum für die Transkriptom-Sequenzierung
- 3 Molekularbiologische Methoden
- 3.1 Isolierung von Gesamt-DNA aus C. glutamicum
- 3.2 Primer-Design
- 3.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- 3.4 Agarose-Gelelektrophorese
- 3.5 RNA-Aufreinigung mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (PCI)
- 3.6 Kit-basierte Gesamt-RNA-Isolierung aus C. glutamicum
- 3.7 Zwei-Phasen-Extraktion von Gesamt-RNA aus C. glutamicum
- 3.8 Überprüfung der RNA auf DNA-Verunreinigung mittels PCR
- 3.9 Qualitäts- und Quantitätskontrolle von RNA
- 3.10 Abreicherung von rRNA
- 3.11 RNA-Fragmentierung
- 3.12 Anreicherung von nativen Transkriptfragmenten
- 3.13 Prozessierung von 5’-Tri- und Diphosphatenden zu 5’-Monophosphatenden
- 3.14 Phosphorylierung der 5’-Transkriptenden
- 3.15 RNA-Adapter-Ligation
- 3.16 Reverse Transkription
- 3.17 Amplifikation der cDNA-Bibliotheken nach der reversen Transkription
- 3.18 Aufreinigung von cDNA-Bibliotheken
- 3.19 Quantifizierungs- und Qualitätskontrolle von cDNA-Bibliotheken
- 3.20 Sequenzierung von cDNA-Bibliotheken
- 4 Bioinformatische Analysen
- 4.1 Read-Kartierung und Visualisierung der RNAseq-Daten
- 4.2 Detektion von Transkriptionsstarts
- 4.3 Suche von Promotor- und Ribosomenbindestellen-Motiven
- 4.4 Detektion neuer Transkripte
- 4.5 Identifizierung von offenen Leserastern und die Suche nach homologen Proteinen
- 4.6 Detektion und Definition von Operon-Strukturen
- 4.7 Bestimmung und Definition von Transkriptenden
- IV Ergebnisse
- 1 Die Entwicklung zweier RNAseq-Vorbereitungsprotokolle: Sequenzierung nativer 5’-Transkriptenden und Volllängentranskripte
- 2 Die Generierung der Transkriptom-Daten und die Kartierung der erhaltenen Reads auf das Genom von Corynebacterium glutamicum
- 3 Die Auswertung des Datensatzes der nativen 5’-Transkriptenden
- 3.1 Detektion und Klassifizierung von Transkriptionsstarts
- 3.2 Reannotation von proteinkodierenden Genen
- 3.3 Umfassende Motivsuche von σA-abhängigen Promotoren
- 3.4 Definition und Charakterisierung von 5’-UTRs
- 3.5 Analyse und Motivsuche von Ribosomenbindestellen
- 4 Die Auswertung des Datensatzes der Volllängentranskripte
- V Diskussion
- 1 Die zwei etablierten RNAseq-Protokolle ermöglichen eine genomweite Analyse der transkriptionellen Organisation mit Einzelnukleotid-Auflösung
- 2 Der Datensatz der nativen 5’-Transkriptenden liefert eine enorme Anzahl an Transkriptionsstarts und ermöglicht die Identifizierung zugehöriger σA-abhängiger Promotoren in C. glutamicum
- 3 Die Transkriptomsequenzierung zeigt eine hohe Abundanz von leaderless mRNAs in C. glutamicum
- 4 Die Charakterisierung von 5‘-untranslatierten Regionen gibt Hinweise auf neue regulatorische Elemente
- 5 Die umfassende Analyse der Transkriptomsequenzierung liefert das Motiv „AGGag“ als Ribosomenbindestelle für C. glutamicum
- 6 Der Datensatz der Volllängentranskripte klärt die Operon-Strukturen für C. glutamicum auf
- 7 Die Detektion neuer, unbekannter Transkripte liefert eine erhebliche Anzahl von antisense RNAs
- 8 Die Auswertung des Volllängentranskript-Datensatzes ermöglicht eine genaue Untersuchung der Transkriptenden
- VI Ausblick
- VII Literatur
- VIII Anhang