Wang, Yunjie: Charakterisierung von Serpinen des Flussneunauges (Lampetra fluviatilis): ein Beitrag zur Genese von Blutgerinnungskontrolle und Blutdruckregulation in [...]. 2014
Inhalt
- Zusammenfassung
- Einleitung
- Das Flussneunauge (Lampetra fluviatilis)
- Das Renin-Angiotensin-System
- Serpine (serine protease inhibitors)
- Struktur der Serpine
- Reaktionsmechanismus und Kinetik inhibitorischer Serpine
- Klassifikation und Evolution der Serpin-Familie
- Aktivierung der Serpine durch Glykosaminoglykane (GAGs)
- Das Blutgerinnungssystem von Vertebraten
- Ziele der Arbeit
- Material und Methoden
- Material
- Molekularbiologische Methoden
- Gesamt-RNA-Isolierung
- cDNA-Synthese
- Isolierung genomischer DNA aus tierischem Gewebe
- Polymerasekettenreaktion (PCR)
- Aufreinigung der PCR-Produkte
- Agarose-Gelelektrophorese
- Gelextraktion
- Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren
- Subklonierung
- Restriktionsspaltung
- Ligation
- Plasmidisolierung
- DNA-Sequenzierung
- Konstruktion der Expressionsvektoren
- Mikrobiologische Methoden
- Kultivierung von E. coli-Stämmen
- Herstellung von chemisch kompetenten Zellen
- Transformation kompetenter E. coli-Zellen
- Expression rekombinanter Proteine in E. coli
- Zellkultur
- Stammhaltung und Zellpassagierung
- Expression rekombinanter Proteine in tierischen Zellen
- Herstellung von Zellextrakten und Zellenüberständen von COS-7-Zellen
- Kryokonservierung
- Chromatographie
- Isolierung von hLA aus Kulturüberständen
- Isolierung und Reinigung von Lfl_SpnV4_1 aus E. coli
- Proteinbiochemische Methoden
- Methoden zur Charakterisierung von Serpinen
- Konfokale Fluoreszenzmikroskopie
- Bioinformatische Methoden
- Ergebnisse
- Charakterisierung von Angiotensinogen aus L. fluviatilis
- Bioinformatische Analyse des Angiotensinogens
- Produktion von HA-LA und hLA in COS-7-Zellen
- Heparinbindungsfähigkeit von Angiotensinogen aus L. fluviatilis
- Nachweis der inhibitorischen Aktivität von Angiotensinogen aus L. fluviatilis
- Einfluss von Glykosaminoglykanen auf die inhibitorische Aktivität des LA
- Stabile Expression von hLA in der HEK-293-EBNA-Zelllinie
- Isolierung und Reinigung von hLA aus Zellkulturüberständen
- Kinetische Parameter der hLA/Thrombin-Reaktion
- Tyrosin-Sulfatierung
- Typ-1-Angiotensin-II-Rezeptor aus L. fluviatilis und seine Wechselwirkung mit Angiotensin
- Charakterisierung von HCII aus L. fluviatilis (LfHCII)
- Produktion von rekombinantem HA-LfHCII in COS-7-Zellen
- Bestimmung der Heparinbindungsfähigkeit von HA-LfHCII
- Hemmung von -Thrombin durch HA-LfHCII
- Charakterisierung der Serpine Lfl_SpnV4_1 und Lfl_SpnV4_2
- Herstellung von Lfl_SpnV4_1 und Lfl_SpnV4_2 in COS-7-Zellen
- Inhibitorische Aktivität von Lfl_SpnV4_1 und Lfl_SpnV4_2
- Herstellung von biologisch aktivem Lfl_SpnV4_1 in E. coli
- Kinetische Analyse der Hemmung von hFXa durch Lfl_SpnV4_1
- Lokalisierung des HCII- und SpnV4_1-Gens im Neunaugen-Genom
- Diskussion
- Evolution des Renin-Angiotensin-Systems (RAS)
- Thrombin hemmende Serpine aus L. fluviatilis
- Evolution der Regulierung des Thrombins
- Die Serpine Lfl_SpnV4_1 und Lfl_SpnV4_2 aus L. fluviatilis
- Herstellung und Reinigung von biologisch aktivem Lfl_SpnV4_1
- Lfl_SpnV4_1 ist ein wirksamer Inhibitor von hFXa
- Lokalisierung des Gens für Lfl_SpnV4_1
- Die Regulation der Blutgerinnung ursprünglicher Vertebraten
- Ausblick
- Anhang
- Materiallisten
- Chemikalien, Reagenzien, Materialien und Geräte
- Primer
- Kits und DNA- bzw. Protein-Marker
- Antikörper
- Enzyme, Proteasen, Substrate und Inhibitoren
- Bakterienstämme, Zelllinien und Kulturmedien
- Programme und Datenbanken
- Proteinsequenzen aus L. fluviatilis
- Sequenz von Angiotensinogen aus L. fluviatilis (LA)
- Sequenz von HCII aus L. fluviatilis (LfHCII)
- Sequenz von Lfl_SpnV4_1
- Sequenz von Lfl_SpnV4_2
- Sequenz des LfAGTR1-eGFP-Fusionsproteins
- Zur phylogenetischen Analyse verwendete Proteinsequenzen
- Literaturverzeichnis
- Abbildungsverzeichnis
- Tabellenverzeichnis
- Abkürzungsverzeichnis