Content

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   Dedication
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   Inhaltsverzeichnis
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   Abkürzungsverzeichnis
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   Anmerkung zur Zitiertechnik
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   Zusammenfassung
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   1 Zusammenfassung
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   Einleitung
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   2 Die Bedeutung von Plasmid-DNA für die medizinische Anwendung
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   Grundlagen
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  3 Biologischer Hintergrund
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   3.1 Plasmid-DNA-Produktion für die medizinische Anwendung
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   3.2 Zwei Ebenen zur Kontrolle der Plasmidreplikation
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   3.3 Plasmidreplikationskontrolle von ColE1-ähnlichen Plasmiden
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   3.4 Metabolomanalysen
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   3.5 13C-Flussanalysen
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  4 Theoretischer Hintergrund
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   4.1 Modellierung in der Systembiologie
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   4.2 Was ist ein Modell?
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   4.3 Klassifizierung von Modellen
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   4.4 Die Erstellung eines mathematischen Modells
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   4.5 Mathematischer Hintergrund
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   5 Ziel der Arbeit
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   Material und Methoden
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  6 Material
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   6.1 Verwendete Bakterienstämme
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  6.2 Primer, Transposon und Plasmidvektoren
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   6.2.1 Primer
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   6.2.2 Transposon
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   6.2.3 Plasmidvektoren
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  6.3 Enzyme, Chemikalien, Kits und Verbrauchsmaterial
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   6.3.1 Enzyme
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   6.3.2 Chemikalien
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   6.3.3 Kits
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   6.4 Laborgeräte
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   6.4.1 Verbrauchsmaterial
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   6.5 Software
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  6.6 Nährmedien und Medienzusätze
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   6.6.1 Definierte Medien zur Kultivierung von Bakterien
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  6.7 Medienzusätze
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   6.7.1 Antibiotika
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   6.7.2 Agar
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   6.8 Puffer und Lösungen
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   6.8.1 Lösungen zur Herstellung von Dauerkulturen
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   6.8.2 Puffer zur Herstellung chemisch kompetenter Zellen
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   6.8.3 Puffer für die DNA-Agarosegelelektrophorese
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   6.8.4 Puffer für die HPLC-Analysen
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  7 Methoden
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  7.1 Kultivierung von Bakterien
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   7.1.1 Anzucht von Bakterien
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   7.1.2 Herstellung von Dauerkulturen
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   7.1.3 Bestimmung des Bakterientiters
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   7.2 Isolierung und Darstellung von DNA
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   7.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA mittels „Thermo Scientific - GeneJET Plasmid Miniprep Kit“
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   7.2.2 Konzentrationsbestimmung einer DNA-Lösung
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   7.2.3 Agarosegelelektrophorese
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   7.2.4 Größenbestimmung von DNA-Fragmenten
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   7.2.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mittels „MN - PCR clean-up and Gel extraction Kit“
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  7.3 Restriktion und Modifikation von DNA
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   7.3.1 DNA- Restriktion mit Typ II Restriktionsendonukleasen
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   7.3.2 Dephosphorylierung von 5'-DNA-Enden
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   7.3.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)
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   7.3.4 Aufreinigung von PCR Produkten mittels „MN - PCR clean-up and Gel extraction Kit“
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   7.3.5 Ligation
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  7.4 DNA-Transfer mittels chemischer Transformation
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   7.4.1 Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen mittels CaCl2-Methode (Protokoll der Plasmid Factory)
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   7.4.2 Transformation kompetenter E. coli Zellen
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   7.5 Erstellung eines RNA-Standards und Durchführung von qRT-PCR
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   7.5.1 PCR zur Amplifikation des RNAI- und RNAII-Gens zum Einsatz in der T7-RNA-Polymerase-Reaktion
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   7.5.2 T7-RNA-Polymerase-Reaktion
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   7.5.3 Isolierung von RNA mittels „Qiagen - RNeasy plus Mini Kit“
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   7.5.4 Entfernung von DNA mittels DNaseI-Verdau
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   7.5.5 Konzentrationsbestimmung einer RNA-Lösung
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   7.5.6 qRT-PCR mittels „Bioline - SensiMix Probe One-Step Kit“
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   7.6 Absolute Quantifizierung von Plasmid-DNA
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   7.6.1 Absolute Quantifizierung der Plasmid-DNA durch die Firma Plasmid Factory
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   7.6.2 Absolute Quantifizierung der Plasmid-DNA durch die Firma CARPEGEN
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   7.6.3 Absolute Quantifizierung der Plasmid-DNA mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
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  7.7 Durchführung von Metabolomanalysen
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   7.7.1 Zellernte durch Schockgefrieren
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   7.7.2 Extraktion und Derivatisierung der intrazellulären Metabolite
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   7.7.3 Gaschromatographie-Massenspektrometrie
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   7.7.4 Auswertung der GC-MS-Messungen
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  7.8 Durchführung von 13C-Flussanalysen
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   7.8.1 Anzucht der Bakterien und Ernte durch Schockgefrieren
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   7.8.2 Proteinhydrolyse und Derivatisierung
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   7.8.3 Gaschromatographie-Massenspektrometrie
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   7.8.4 Auswertung der GC-MS-Messungen
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   Ergebnisse
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   8 Modellierung der Plasmidreplikationskontrolle
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   8.1 Erstellung des strukturellen Modells
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   8.2 Erfassung der experimentellen Daten
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   8.2.1 Bestimmung der Wachstumsraten
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   8.2.2 Messung der RNAI- und RNAII-Konzentrationen
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   8.2.3 Messung der intrazellulären Plasmidkonzentrationen
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   8.3 Erstellung des dynamischen Modells
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  8.4 Simulationen der Plasmidreplikationskontrolle
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   8.4.1 Simulationen zur Parameteranpassung
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   8.4.2 Prädiktive Simulationen
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  8.5 Entwicklung einer unbeladbaren Transfer-RNA
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   8.5.1 Die Transkriptionseinheit
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   8.5.2 Konstruktion des modifizierten Leucin-tRNA-Gens
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   8.5.3 Vorgehen zur Integration des modifizierten tRNA-Gens in das E. coli Chromosom
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  9 Metabolomanalysen
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   9.1 Untersuchungen zur Metabolitzusammensetzung
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  10 13C-Flussanalysen
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   10.1 Ermittlung der Isotopomer-Verteilung
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   10.2 Das metabolische Flussmodell
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   10.3 Berechnung des intrazellulären Glukoseflusses
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   Diskussion
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  11 Modellierung der Plasmidreplikationskontrolle
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   11.1 Das Modell
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   11.2 Untermauerung des Modells mit experimentellen Daten
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  11.3 Simulationen der Plasmidreplikationskontrolle
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   11.3.1 Simulationen zur Parameteranpassung
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   11.3.2 Prädiktive Simulationen
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  12 Das Metabolom und der intrazelluläre Glukosefluss
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   12.1 Das Metabolom in Abhängigkeit des Plasmidgehalts
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   12.2 Betrachtung des Glukoseflusses via 13C-Flussanalysen
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   12.3 Fazit und Ausblick
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   Anhang
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   Literaturverzeichnis
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   Danksagung
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   Kolophon
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   Erklärung