Inhalt

•  
   Dedication
•  
   Inhaltsverzeichnis
•  
   Abkürzungsverzeichnis
•  
   Anmerkung zur Zitiertechnik
•  
   Zusammenfassung
•  
   1 Zusammenfassung
•  
   Einleitung
•  
   2 Die Bedeutung von Plasmid-DNA für die medizinische Anwendung
•  
   Grundlagen
•  
  3 Biologischer Hintergrund
•  
   3.1 Plasmid-DNA-Produktion für die medizinische Anwendung
•  
   3.2 Zwei Ebenen zur Kontrolle der Plasmidreplikation
•  
   3.3 Plasmidreplikationskontrolle von ColE1-ähnlichen Plasmiden
•  
   3.4 Metabolomanalysen
•  
   3.5 13C-Flussanalysen
•  
  4 Theoretischer Hintergrund
•  
   4.1 Modellierung in der Systembiologie
•  
   4.2 Was ist ein Modell?
•  
   4.3 Klassifizierung von Modellen
•  
   4.4 Die Erstellung eines mathematischen Modells
•  
   4.5 Mathematischer Hintergrund
•  
   5 Ziel der Arbeit
•  
   Material und Methoden
•  
  6 Material
•  
   6.1 Verwendete Bakterienstämme
•  
  6.2 Primer, Transposon und Plasmidvektoren
•  
   6.2.1 Primer
•  
   6.2.2 Transposon
•  
   6.2.3 Plasmidvektoren
•  
  6.3 Enzyme, Chemikalien, Kits und Verbrauchsmaterial
•  
   6.3.1 Enzyme
•  
   6.3.2 Chemikalien
•  
   6.3.3 Kits
•  
   6.4 Laborgeräte
•  
   6.4.1 Verbrauchsmaterial
•  
   6.5 Software
•  
  6.6 Nährmedien und Medienzusätze
•  
   6.6.1 Definierte Medien zur Kultivierung von Bakterien
•  
  6.7 Medienzusätze
•  
   6.7.1 Antibiotika
•  
   6.7.2 Agar
•  
   6.8 Puffer und Lösungen
•  
   6.8.1 Lösungen zur Herstellung von Dauerkulturen
•  
   6.8.2 Puffer zur Herstellung chemisch kompetenter Zellen
•  
   6.8.3 Puffer für die DNA-Agarosegelelektrophorese
•  
   6.8.4 Puffer für die HPLC-Analysen
•  
  7 Methoden
•  
  7.1 Kultivierung von Bakterien
•  
   7.1.1 Anzucht von Bakterien
•  
   7.1.2 Herstellung von Dauerkulturen
•  
   7.1.3 Bestimmung des Bakterientiters
•  
   7.2 Isolierung und Darstellung von DNA
•  
   7.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA mittels „Thermo Scientific - GeneJET Plasmid Miniprep Kit“
•  
   7.2.2 Konzentrationsbestimmung einer DNA-Lösung
•  
   7.2.3 Agarosegelelektrophorese
•  
   7.2.4 Größenbestimmung von DNA-Fragmenten
•  
   7.2.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mittels „MN - PCR clean-up and Gel extraction Kit“
•  
  7.3 Restriktion und Modifikation von DNA
•  
   7.3.1 DNA- Restriktion mit Typ II Restriktionsendonukleasen
•  
   7.3.2 Dephosphorylierung von 5'-DNA-Enden
•  
   7.3.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)
•  
   7.3.4 Aufreinigung von PCR Produkten mittels „MN - PCR clean-up and Gel extraction Kit“
•  
   7.3.5 Ligation
•  
  7.4 DNA-Transfer mittels chemischer Transformation
•  
   7.4.1 Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen mittels CaCl2-Methode (Protokoll der Plasmid Factory)
•  
   7.4.2 Transformation kompetenter E. coli Zellen
•  
   7.5 Erstellung eines RNA-Standards und Durchführung von qRT-PCR
•  
   7.5.1 PCR zur Amplifikation des RNAI- und RNAII-Gens zum Einsatz in der T7-RNA-Polymerase-Reaktion
•  
   7.5.2 T7-RNA-Polymerase-Reaktion
•  
   7.5.3 Isolierung von RNA mittels „Qiagen - RNeasy plus Mini Kit“
•  
   7.5.4 Entfernung von DNA mittels DNaseI-Verdau
•  
   7.5.5 Konzentrationsbestimmung einer RNA-Lösung
•  
   7.5.6 qRT-PCR mittels „Bioline - SensiMix Probe One-Step Kit“
•  
   7.6 Absolute Quantifizierung von Plasmid-DNA
•  
   7.6.1 Absolute Quantifizierung der Plasmid-DNA durch die Firma Plasmid Factory
•  
   7.6.2 Absolute Quantifizierung der Plasmid-DNA durch die Firma CARPEGEN
•  
   7.6.3 Absolute Quantifizierung der Plasmid-DNA mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
•  
  7.7 Durchführung von Metabolomanalysen
•  
   7.7.1 Zellernte durch Schockgefrieren
•  
   7.7.2 Extraktion und Derivatisierung der intrazellulären Metabolite
•  
   7.7.3 Gaschromatographie-Massenspektrometrie
•  
   7.7.4 Auswertung der GC-MS-Messungen
•  
  7.8 Durchführung von 13C-Flussanalysen
•  
   7.8.1 Anzucht der Bakterien und Ernte durch Schockgefrieren
•  
   7.8.2 Proteinhydrolyse und Derivatisierung
•  
   7.8.3 Gaschromatographie-Massenspektrometrie
•  
   7.8.4 Auswertung der GC-MS-Messungen
•  
   Ergebnisse
•  
   8 Modellierung der Plasmidreplikationskontrolle
•  
   8.1 Erstellung des strukturellen Modells
•  
   8.2 Erfassung der experimentellen Daten
•  
   8.2.1 Bestimmung der Wachstumsraten
•  
   8.2.2 Messung der RNAI- und RNAII-Konzentrationen
•  
   8.2.3 Messung der intrazellulären Plasmidkonzentrationen
•  
   8.3 Erstellung des dynamischen Modells
•  
  8.4 Simulationen der Plasmidreplikationskontrolle
•  
   8.4.1 Simulationen zur Parameteranpassung
•  
   8.4.2 Prädiktive Simulationen
•  
  8.5 Entwicklung einer unbeladbaren Transfer-RNA
•  
   8.5.1 Die Transkriptionseinheit
•  
   8.5.2 Konstruktion des modifizierten Leucin-tRNA-Gens
•  
   8.5.3 Vorgehen zur Integration des modifizierten tRNA-Gens in das E. coli Chromosom
•  
  9 Metabolomanalysen
•  
   9.1 Untersuchungen zur Metabolitzusammensetzung
•  
  10 13C-Flussanalysen
•  
   10.1 Ermittlung der Isotopomer-Verteilung
•  
   10.2 Das metabolische Flussmodell
•  
   10.3 Berechnung des intrazellulären Glukoseflusses
•  
   Diskussion
•  
  11 Modellierung der Plasmidreplikationskontrolle
•  
   11.1 Das Modell
•  
   11.2 Untermauerung des Modells mit experimentellen Daten
•  
  11.3 Simulationen der Plasmidreplikationskontrolle
•  
   11.3.1 Simulationen zur Parameteranpassung
•  
   11.3.2 Prädiktive Simulationen
•  
  12 Das Metabolom und der intrazelluläre Glukosefluss
•  
   12.1 Das Metabolom in Abhängigkeit des Plasmidgehalts
•  
   12.2 Betrachtung des Glukoseflusses via 13C-Flussanalysen
•  
   12.3 Fazit und Ausblick
•  
   Anhang
•  
   Literaturverzeichnis
•  
   Danksagung
•  
   Kolophon
•  
   Erklärung