Haasner, Kathrin: Untersuchung des Argininmetabolismus und dessen Regulation in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. 2013
Inhalt
- 2. Kathrin_DISS_Inhaltsverzeichnis
- 2.1 Kathrin_DISS_Abbildungsverzeichnis
- 2.2 Kathrin_DISS_Tabellenverzeichnis
- 2.3 Kathrin_DISS_Abkürzungsverzeichnis
- 3. Kathrin_DISS_Zusammenfassung
- 4. Kathrin_DISS_Einleitung-KH_fertig
- 5. Kathrin_DISS_Material und Methoden-fertig
- III. Material und Methoden
- PIPES (Piperazin-1,4-bis(2-ethansulfonsäure)
- 2.3. Geräte und Apparaturen
- 2.4. Software
- 3. Medien
- 3.1. Nährmedien
- 3.2. Zusätze zu den Nährmedien
- 3.3. Verwendete Puffer und Lösungen
- 3.3.1. Elektrophorese
- 3.3.3. Auftrennung der RNA im Polyacrylamidgel und Semi-Dry Elektroblot
- 3.3.4. Hybridisierung des Northern Blots
- 3.3.5. Waschung und Detektion des Northern Blots
- 3.3.6 Proteinpuffer
- 4. Kultivierung von Bakterien
- 4.1. Anzucht und Lagerung
- 4.2. Bestimmung des Bakterientiters
- 4.3. Stochertest
- 5. Allgemeine DNA-Arbeiten
- 5.1. Isolierung von Plasmid-DNA
- 5.2. Aufreinigung von PCR-Produkten
- 5.3. Agarose-Gelelektrophorese
- 5.4. Isolierung von DNA-Fragmenten aus einem Agarosegel
- 6. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- 6.1. Primer Design
- 6.2. PCR-Reaktionsansätze und -programme
- 6.2.1. PCR-Reaktionsansatz und -programm für die taq-Polymerase
- 6.2.2. PCR-Reaktionsansatz und -programm für die Phusion-Polymerase
- 7. Klonierungsexperimente
- 7.1. DNA-Restriktionsspaltung
- 7.2. DNA-Ligation
- 8. DNA-Transfertechniken
- 8.1. Elektroporation
- 8.1.1. Herstellung und Elektroporation elektrokompetenter E. coli-Zellen
- 8.1.2. Herstellung und Elektroporation elektrokompetenter C. glutamicum-Zellen
- 9. Erzeugung von Gendeletionen und -mutationen
- 9.1. Konstruktion von Deletions- und Mutationskonstrukten mittels Gene Splicing by Overlap Extension (GeneSOEing)
- 9.2. Integration einer Deletion bzw. Mutation im Chromosom
- 10. Transkriptomics
- 10.1. Ernte und Isolierung der Gesamt-RNA aus C. glutamicum-Zellen
- 10.2. Northern Blot für kleine RNAs (50 – 800 nt)
- 10.3. Northern Blot für größere Transkripte (500 – 10000 nt)
- 10.4. Expressionsanalyse mittels RT-qPCR
- 10.4.1. 1-Schritt RT-qPCR
- 10.4.2. 2-Schritt RT-qPCR
- 6. Kathrin_DISS_Ergebnisse_fertig
- IV. Ergebnisse
- 1. Charakterisierung der transkriptionellen Organisation des Arginin-Operons von Corynebacterium glutamicum
- 2. Beschreibung und biologische Relevanz einer antisense RNA gegenüber argC, dem ersten Gen des Argininoperons
- 2.1. Die Transkriptomsequenzierung von C. glutamicum enthüllt eine antisense RNA gegenüber argC
- 2.2. Durch Einbringung einer Mutation in die Promotorregion von asaC wird die argC Transkription beeinflusst
- 2.3. Eine Überexpression der antisense RNA in trans hat keinen Einfluss auf die argC Transkription und validiert ‚Transkriptionelle Interferenz‘ als regulatorischen Mechanismus
- 3. Eine neue Variante von N-Acetylglutamat Synthase ist verantwortlich für den ersten Schritt der Argininbiosynthese in C. glutamicum
- 3.1. Die Akkumulierung von intrazellulären Arginin-Intermediaten gibt Hinweise auf eine unbekannte N-Acetylglutamat Synthase
- 3.2. Auffindung eines Gens, dessen Protein den ersten Argininbiosyntheseschritt durchführen kann
- 3.3. Validierung der Genfunktion von cg3035 durch heterologe Komplementation, metabolische Analyse, Enzymassays und Gendeletion
- 3.4. Cg3035 begründet eine neue Klasse von NAGS-Genen
- 7. Kathrin_DISS_Diskussion-fertig
- 8. Kathrin_DISS_Literatur
- 9. Kathrin_DISS_Anhang
- 10. Kathrin_DISS_Danksagung