Hinse, Dennis: Molekulargenetische Charakterisierung von Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus : vergleichende Genomanalyse und Evaluation von Stammtypisier [...]. 2012
Inhalt
- 1 Zusammenfassung
- 2 Einleitung
- 2.1 Taxonomie der Streptokokken
- 2.2 Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus
- 2.2.1 S. gallolyticus subsp. gallolyticus als Pathogen
- 2.2.2 S. gallolyticus subsp. gallolyticus in der infektiösen Endokarditis
- 2.2.3 Assoziation von S. gallolyticus subsp. gallolyticus mit Neoplasien des Kolons
- 2.3 Virulenzfaktoren von Streptokokken
- 2.4 Grundlagen der Genomsequenzierung
- 2.5 Grundlagen der DNA-Chip Technologie
- 3 Ergebnisse
- 3.1 Identifikation und Nachweis von S. gallolyticus subsp. gallolyticus
- 3.1.1 Molekulargenetische Identifikation mittels sodA DNA-Sequenzierung
- 3.1.2 MALDI-TOF-MS Identifizierung
- 3.1.3 Real-time PCR zum Nachweis von S. gallolyticus subsp. gallolyticus
- 3.1.4 Prävalenz von S. gallolyticus subsp. gallolyticus im humanen Gastrointestinaltrakt
- 3.2 Molekulardiagnostische Charakterisierung von S. gallolyticus subsp. gallolyticus
- 3.2.1 rep-PCR Klassifizierung
- 3.2.2 RAPD-PCR / ERIC-PCR Analyse
- 3.2.3 Klassifizierung mittels MLST
- 3.2.4 Korrelation der Charakterisierungsmethoden
- 3.3 Genomsequenzierung und Analyse von S. gallolyticus subsp. gallolyticus
- 3.3.1 Allgemeine Genomeigenschaften
- 3.3.2 Detektion und Analyse potentieller Virulenzgene
- 3.3.3 Vergleichende Genomanalyse
- 3.3.4 Plasmid pSGG1
- 3.4 Analyse der Verbreitung von Virulenz-assoziierten Genen mittels Microarray-Experimenten
- 3.4.1 Etablierung eines DNA-Microarrays
- 3.4.2 Ergebnisse des Microarray-Screenings
- 3.4.2.1 Phylogenetische Analyse der Microarray-Daten
- 3.4.2.2 Auswertung der Microarray-Daten auf Basis der Kollagenbindung
- 3.4.2.3 Analyse der Verteilung kapsulärer Gene
- 3.4.2.4 Microarray-Analyse anhand bekannter phänotypischer Eigenschaften
- 3.4.3 Bestätigung der Microarray-Experimente durch konventionelle PCR
- 4 Diskussion
- 4.1 Identifikation und Nachweis von S. gallolyticus subsp. gallolyticus
- 4.1.1 Molekulargenetische und MALDI-TOF-MS basierte Identifikation von S. gallolyticus subsp. gallolyticus
- 4.1.2 Nachweis von S. gallolyticus subsp. gallolyticus im humanen Fäzes
- 4.2 Transmission von S. gallolyticus subsp. gallolyticus
- 4.3 Genomsequenzierung und Analyse von S. gallolyticus subsp. gallolyticus
- 4.4 Analyse der Verbreitung von Virulenz-assoziierten Genen mittels Microarray-Experimenten
- 4.5 Ausblick
- 5 Methoden
- 5.1 Mikrobiologische Methoden
- 5.1.1 Anzucht und Kultivierung von Bakterien
- 5.1.2 Herstellen einer Kryokultur
- 5.1.3 Bindung an Kollagenoberflächen
- 5.1.4 Analyse der Tetracyclin Suszeptibilität
- 5.2 Molekulargenetische Methoden
- 5.2.1 Nukleinsäureextraktion aus Reinkulturen
- 5.2.2 Nukleinsäureextraktion mit dem UltraClean Microbial DNA Isolation Kit
- 5.2.3 DNA-Extraktion aus humanem Fäzes
- 5.2.4 Isolierung von Gesamt-DNA mittels Phenol-Chloroform Extraktion
- 5.2.5 Plasmid-DNA Extraktion mit dem NucleoBond PC Kit
- 5.2.6 Quantifizierung der Nukleinsäurekonzentration
- 5.2.7 PCR im Block-Thermocycler
- 5.2.8 Real-time PCR Analyse
- 5.2.9 Aufreinigung von DNA mit dem QIAquick PCR Purification Kit
- 5.2.10 Genomisches Fingerprinting (RAPD-PCR / ERIC-PCR)
- 5.2.11 Genomisches Fingerprinting rep-PCR Analyse
- 5.2.12 Analyse von PCR–Amplifikaten mittels Kapilliargelelektrophorese
- 5.2.13 Spaltung von DNA mittels Restriktionsendonukleasen
- 5.2.14 Agarosegelelektrophorese
- 5.2.15 Transfer von DNA-Fragmenten mittels Vakuum (Southern Blot)
- 5.2.16 Southern-Hybridisierung
- 5.2.17 Detektion des kolorimetrischen Nachweises
- 5.3 DNA-Sequenzierung (Cycle Sequencing)
- 5.3.1 Aufreinigung der PCR-Amplifikate für die Sequenzierung
- 5.3.2 Sequenzierung mit dem BigDye Terminator Kit
- 5.3.3 Reinigung von Sequenzieransätzen mittels Sephadex G50 Gelfiltration
- 5.3.4 Analyse der DNA-Sequenzierungsprodukte mittels Kapillargel-elektrophorese
- 5.4 MALDI-TOF-MS Analyse
- 5.5 Genomsequenzierung
- 5.5.1 Genom-Sequenzierung und Lückenschluss
- 5.5.2 Annotation des Genom
- 5.5.3 Berechnung des phylogenetischen Stammbaums
- 5.5.4 GC skew Analyse
- 5.6 Microarray
- 6 Material und Geräte
- 6.1 Bakterienstämme
- 6.2 Enzyme
- 6.3 Reagenzien
- 6.4 Puffer und Lösungen
- 6.5 Nährmedien
- 6.6 Testkits
- 6.7 Oligonukleotide
- 6.8 DNA-Größenmarker
- 6.9 Software
- 6.10 Geräte
- 6.11 Sonstige Materialien
- 7 Abkürzungen
- 8 Literatur
- 9 Anhang