Yahiatene, Idir: Konfokale Mehrfarben Einzelmolekülspektroskopie in Mikrokanälen zur Charakterisierung biologischer Proben. 2012
Inhalt
- Zusammenfassung
- Abstract
- Einleitung
- Theoretische Grundlagen
- Biochemischer Aufbau der DNA
- Nachweis von DNA mit Hilfe von PCR
- Absorption und Emission
- Jablonski-Diagramm zur Fluoreszenz
- Franck-Condon-Prinzip
- Stokes-Verschiebung
- Fluoreszenzlebensdauer und Quantenausbeute
- Effekte der Fluoreszenzlöschung
- Statische- und dynamische Löschung - Die Stern-Volmer Analyse
- Prinzip des Photoinduzierten Elektronentransfers (PET)
- Förster Resonanz-Energietransfer (FRET)
- Hintergrundsignal durch Streuung
- Grundzüge der Strömungsmechanik
- Material und Methoden
- Verwendete Geräte und Anlagen
- Beschreibung der konfokalen Einzelmolekülanlage
- Ensembleproben
- Absorptionsmessungen
- Ensemble-Fluoreszenz
- Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)
- Beschreibung von Algorithmen zur Einzelmoleküldetektion
- Zubereitung der verwendeten Proben
- Herstellung des Mikrofluidikkanals
- Verwendete Software zur Datenaufnahme und Auswertung
- Ergebnisse
- Stand der Technik - Bursterkennung
- Verschiedene Parameter von Atto655 als Funktion der Anregungsleistung
- Burstrate von Atto565 als Funktion der Konzentration
- Charaktersisierung der Einzelmolekülanlage
- Spektrale Charakterisierung der Detektionskanäle
- Eindringtiefenvariation und Bestimmung relevanter Parameter
- Mikrofluidische Experimente
- Vorexperimente zur mikrofluidischen Detektion von einzelnen Molekülen
- Beobachtung der Teilchenzahl als Funktion des Ortes entlang des Kanalquerschnitts
- Kontrolle der Flüssigkeit durch Anlegen von Druck
- Semi-quantitatives Modell zur Beschreibung der Geschwindigkeitverteilung im Mikrokanal
- Verifizierung der parabolischen Geschwindigkeitsverteilung durch FCS Messungen
- Messung der Transitzeit als Funktion des Drucks
- Bestimmung des SNR als Funktion des Drucks
- Untersuchung der Signalhöhenverteilungen als Funktion des Drucks
- Verifizierung der laminaren Strömung durch Reynoldszahlen
- Sensitivitätserhöhung durch Anlegen von Druck
- Detektion von Farbstoffmolekülen auf 130 nm Beads
- Multiplexing Experimente
- Koinzidenzmessungen und die Korrelationsmatrix- Methode
- Einführung der Korrelationsmatrix-Methode
- Monte-Carlo Einzelmolekülsimulationen zur -Norm
- Chrakterisierung von statistsichen Koinzidenzereignissen mittels Korrelationsmatrix-Methode
- Doppelt gelabelter DNA-Doppelstrang als Koinzidenzprobe
- Ausnutzung der M280-Bead Autofluoreszenz als ideale Koinzidenzprobe
- DNA-Detektion und Quantifizierung
- Ausblick und Diskussion
- Anhang
- Abbildungsverzeichnis
- Literaturverzeichnis