Inhalt

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   Inhaltsverzeichnis
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   1 Einleitung
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  2 Theorie
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   2.1 Escherichia coli – Aufbau der Zellhülle
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   2.2 Escherichia coli – Proteinexportsysteme
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   2.2.1 Der generelle Sekretionspfad (Sec)
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   2.2.2 Die Zwillingsarginin-Translokation (Tat)
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   2.2.3 Weitere Proteintransportmechanismen
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  Das Signal Recognition Particle (SRP)
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   Die -Hämolysin-Sekretion (Typ I)
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   Das flagellare Typ III Sekretionssystem (TTSS)
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   Das YebF-Carrierprotein
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   2.3 Freisetzung periplasmatischer Proteine
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   2.3.1 Bacteriocin freisetzende Proteine (BRP)
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   2.3.2 Sekretion periplasmatischer Proteine durch BRP-Coexpression
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   2.4 Modellproteine für die sekretorische Produktion
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   2.4.1 Die alkalische Phosphatase
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   2.4.2 Die -Lactamase
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   2.4.3 Die Ribonuklease Ba (Barnase)
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   2.4.4 Das grünfluoreszierende Protein (GFP)
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   2.4.5 Das Maltosebindeprotein (MBP)
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   2.5 Das Arabinoseoperon araBAD und der Arabinosepromotor PBAD
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   3 Ziele der Arbeit
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  4 Material und Methoden
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  4.1 Mikrobiologische Methoden
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   4.1.1 Bakterienstämme und Plasmide
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   4.1.2 Medien
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   4.1.3 Stammhaltung
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   4.1.4 Kultivierung von E. coli in Flüssigmedium und auf Festagar
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   4.1.5 Satzkultivierung von E. coli im Bioreaktor
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   4.1.6 Hochzelldichtekultivierung von E. coli im Zulaufverfahren
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   4.1.7 Induktion des PBAD-Promotors durch L-Arabinose
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   4.1.8 Fraktionierter Zellaufschluss
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   4.1.9 Präparation löslicher und unlöslicher Proteine
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   4.1.10 Herstellung und Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen
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   4.1.11 Herstellung und Transformation elektrokompetenter E. coli-Zellen
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  4.2 Kultivierungsanalytik
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   4.2.1 Bestimmung der optischen Dichte
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   4.2.2 Bestimmung der Biotrockenmassekonzentration
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   4.2.3 Bestimmung der Plasmidstabilität
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   4.2.4 Konzentrationsbestimmung von Glycerin, Arabinose und Glucose
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   4.2.5 Bestimmung der Ammoniumkonzentration
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  4.3 Molekularbiologische Methoden
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   4.3.1 Plasmidisolierung
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   4.3.2 Isolierung genomischer DNA aus E. coli
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   4.3.3 Agarosegelelektrophorese
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   4.3.4 Polymerasekettenreaktion
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   4.3.5 Restriktionsspaltung von Plasmiden und PCR-Produkten
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   4.3.6 Aufreinigung von PCR-Produkten und DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
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   4.3.7 Ligation von DNA-Fragmenten
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   4.3.8 Erzeugung chromosomaler Mutationen
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   4.3.9 Bestimmung von Nukleinsäurekonzentrationen
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   4.3.10 DNA-Sequenzierung
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  4.4 Proteinreinigung
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   4.4.1 Diafiltration
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   4.4.2 Affinitätschromatographische Reinigung von MBP und MBP-Hybridproteinen
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   4.5 Proteinanalytik
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   4.5.1 Tris-Glycin SDS-PAGE
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   4.5.2 Tris-Tricin SDS-PAGE
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   4.5.3 Western-Blot und immunologische Detektion
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   4.5.4 Bestimmung der Proteingesamtkonzentration
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   4.5.5 Bestimmung der Fluoreszenz des grünfluoreszierenden Proteins
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   4.5.6 Aktivitätsbestimmung der alkalischen Phosphatase
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   4.5.7 Aktivitätsbestimmung der -Lactamase
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   4.5.8 Aktivitätsbestimmung der Barnase
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   4.5.9 Aktivitätsbestimmung der -Galaktosidase
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  4.6 Transkriptanalytik
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   4.6.1 Gesamt-RNA-Isolierung und DNAse-Verdau
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   4.6.2 Genexpressionsanalyse mit der DNA-Chiptechnologie
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   4.6.3 Bestimmung der Genexpression durch quantitative RT-PCR
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  5 Ergebnisse und Diskussion
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   5.1 Etablierung eines Expressionssystems für die Sekretion rekombinanter Modellproteine: Stammentwicklung
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   5.1.1 Konstruktion eines plasmidbasierten Expressions- und Sekre tionssystems für rekombinante Proteine
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   5.1.2 Konstruktion eines geeigneten E. coli-Stammes
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   5.1.3 Funktionelle Charakterisierung des Expressionssystems
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   5.1.4 Auswahl eines geeigneten BRPs
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   5.1.5 Molekulare Optimierung des LppBRP: Funktionalität und Toxizität von LppBRP-Hybridproteinen
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   5.1.6 Schlussfolgerungen zur Etablierung eines geeigneten Sekretionssystems
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  5.2 Optimierung der extrazellulären Proteinproduktion durch kontrollierte BRP-Coexpression
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   5.2.1 Optimierung der extrazellulären Proteinproduktion durch angepasste BRP-Coexpression
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   Wachstum und Energieverbrauch
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   Zelllyse und Quasi-Lyse
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   Plasmidstabilität
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   Beurteilung der Sekretionseffizienz
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  5.2.2 Steigerung der extrazellulären Proteinproduktion durch Hochzell dichtekultivierung
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   Etablierung einer geeigneten Zufütterungsstrategie
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   Sekretorische Proteinproduktion
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   5.2.3 Kinetik der BRP-Expression und Proteinsekretion
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   5.2.4 Analyse der Genexpression unter BRP-Aktivität
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  5.2.5 Optimierung der extrazellulären Proteinproduktion durch starke BRP-Expression bei maximalen Zelldichten
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   Manuelle Induktion der Proteinsekretion bei maximalen Zelldichten
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   Autoregulatorische Induktion der Proteinsekretion bei Substraterschöpfung
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   5.2.6 Schlussfolgerungen zur Optimierung der extrazellulären Proteinproduktion durch regulierte BRP-Coexpression
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   5.3 Extrazelluläre Produktion und Affinitätsreinigung rekombinanter Proteine durch Nutzung des Maltosebindeproteins
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   5.3.1 MBP-Sekretion nach Export über Sec- und Tat-Pfad
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   5.3.2 Extrazelluläre Produktion von MBP-Hybridproteinen
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   Sekretorische Produktion von MBP-Barnase und SPTorA-mMBP-Barnase
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   Sekretorische Produktion von MBP-AP und SPTorA-mMBP-AP
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   Sekretorische Produktion von SPTorA-mMBP-GFP
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   Schlussfolgerungen
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   5.3.3 Affinitätsreinigung extrazellulärer MBP-Fusionsproteine
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   5.3.4 Schlussfolgerungen zur extrazellulären Produktion und Affinitätsreinigung von MBP-Hybridproteinen
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   6 Zusammenfassung
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   7 Ausblick
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   8 Literaturverzeichnis
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  9 Anhang
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   9.1 Formelzeichen und Symbole
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   9.2 Indices
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   9.3 Abkürzungen
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   9.4 Präfixe
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   9.5 Plasmide
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   9.6 Oligonukleotide (Primer)
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  9.7 Ergänzende Daten
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   9.7.1 Kultivierungsverläufe zur sekretorischen Produktion von MBP-Hybridproteinen
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   9.7.2 Korrektur der Hintergrundfluoreszenz GFP-exprimierender Kulturen
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   9.7.3 Chromatogramme der Affinitätsreinigung verschiedener MBP-Hybridproteine
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   9.8 Chemikalien
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   9.9 Geräte
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  10 Publikationen
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   10.1 Forschungsarbeiten
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   10.2 Vorträge, Kurzfassungen und Poster
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   11 Danksagung
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   Erklärung