Inhalt

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   Zusammenfassung V
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  Die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) 2
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   Die Struktur und Modifikationen der C-Untereinheit 4
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   Die Funktion und Regulation der R-Untereinheiten 6
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   Die Lokalisation der PKA über AKAPs 7
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   Die Funktionen des Proteinkinase-Inhibitors (PKI) 9
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   Die Kern-Cytoplasma-Translokation 11
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   Die Kern-Cytoplasma-Translokation der C-Untereinheiten 19
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   Arbeitshypothese 22
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  1 Material 24
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   Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 24
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   Peptide 25
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   Antikörper 26
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  2 Mikrobiologische Methoden 26
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   2.1 Bakterienstämme 26
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   2.2 Plasmide 26
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   2.3 Nährmedien 27
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   2.4 Bakterienanzucht 27
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   2.5 Bestimmung der Bakterienzelldichte 28
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   2.6 Herstellung transformationskompetenter E. coli-Bakterien 28
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   2.7 Transformation / Cotransformation 28
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  3 Molekularbiologische Methoden 29
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  3.1 Aufreinigung von DNA 29
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   3.1.1 Plasmidpräparation (Minipräparation) 29
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   3.1.2 Extraktion von DNA aus Agarosegelen 29
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   3.1.3 Reinigung von PCR-Produkten 30
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   3.2 Agarose-Gelelektrophorese 30
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   3.3 Konzentrationsbestimmung der DNA 30
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  3.4 Klonierung 31
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   3.4.1 Restriktionsspaltung von DNA 31
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   3.4.2 DNA-Dephosphorylierung 31
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   3.4.3 Ligation von DNA-Fragmenten 32
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  3.5 Mutagenesen 32
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   3.5.1 Mutagenese mit dem QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 32
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   3.5.2 PCR 32
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   3.6 DNA-Sequenzierung 33
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  4 Proteinbiochemische Methoden 33
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   4.1 Expression rekombinanter Proteine 33
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  4.2 Präparation rekombinanter Proteine 34
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   4.2.1 Bakterienzell-Aufschluß 34
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   4.2.2 Aufreinigung der C-Untereinheit der PKA über PKI (5-24)-Affinitätschromato-
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   graphie 34
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   4.2.3 Aufreinigung der GST-Fusionsproteine über Glutathion-Affinitätschromato-
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   graphie 35
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   4.2.4 Nachreinigung der C-Untereinheit der PKA durch Mono-S-Ionenaustauscher-Chromatographie 36
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   4.3 Konzentrieren und Umpuffern von Proteinen 37
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   4.4 Bestimmung der Proteinkonzentration 37
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   4.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 37
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   4.6 Transfer von Proteinen auf PVDF-Membranen (Western Blot) 38
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   4.7 Isoelektrische Fokussierung 39
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   4.8 Gelfiltration 40
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   4.9 Bestimmung der Kinase-Aktivität 41
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   4.10 Konjugation von Fluoreszenzfarbstoffen an Proteine 43
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   4.11 Massenspektrometrische Untersuchungen 44
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   5 Mikroinjektion von Proteinen in Zellkulturzellen 44
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   5.1 Kultivierung und Handhabung der Zellen für die Mikroinjektionsexperimente 44
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   5.2 Kapillaren 45
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   5.3 Injektionsproben 46
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   5.4 Mikroinjektion mit dem halbautomatischen System von Eppendorf 47
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   5.5 Inkubation der injizierten Zellen 48
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   5.6 Konservierung der Präparate 49
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   5.7 Detektion und Auswertung 49
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   6 Indirekte Immunfluoreszenz 50
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   7 Importkinetik / Import Assay 51
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   8 Depletion 52
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  1 Erzeugung einer Mutante der C(-Untereinheit, von C(-Fusionsproteinen und von PKI 53
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   1.1 Herstellung der C(-Doppelmutante rC(myr (H87Q/W196R) 53
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   1.2 Herstellung der C(-Untereinheit als (-Galaktosidase-Fusionsprotein 56
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   Konstruktion des C((1-40)-GST-Fusionsproteins 58
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   De novo-Synthese des Proteinkinase-Inhibitors PKI 60
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  2 Vorversuche zur quantitativen Bestimmung von Fluoreszenzintensitäten in Kern und Cytoplasma und dem sich daraus ergebenden Quotienten FK/C 62
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   Einfluß der Zellinie auf FK/C 62
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   Einfluß der Auswertebereiche innerhalb der Zellen auf FK/C 63
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   Einfluß der Eigenfluoreszenz (Hintergrund) auf FK/C 65
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   Einfluß der optischen Kontamination auf FK/C 65
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   Einfluß der Konzentration der injizierten Proben auf FK/C bei nicht kerngängigen Proben 68
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  3 Charakterisierung der Proben für Mikroinjektion und Import-Assay 70
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   3.1 Bestimmung des Phosphorylierungsgrades über Kationenaustauscher-Chromatographie (Mono-S) 71
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   3.2 Bestimmung der Molekülmassen durch Massenspektrometrie 72
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   3.3 Isoelektrische Fokussierung 74
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   3.4 Vergleichende Analyse von Dissoziationskonstanten mittels Resonant Mirror Affinographie 75
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   3.5 Gelfiltrationschromatographie zum Vergleich des Diffusionsverhaltens von rC(myr mit dem anderer Proteine 76
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   4 Untersuchungen zur Kern-Cytoplasma-Translokation von rC(myr 80
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  4.1 Untersuchungen zur Kern-Cytoplasma-Translokation von rC(myr in Mikroinjektionexperimenten 80
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  4.2 Untersuchungen zur Kern-Cytoplasma-Translokation von rC(myr in Import-Assays 115
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   4.2.1 Vergleich der Translokation von rC(myr und Kontrollproteinen in die Kerne permeabilisierter HeLa-Zellen 116
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   4.2.2 Import-Kinetiken von rC(myr in die Kerne permeabilisierter HeLa-Zellen 118
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   4.2.3 Einfluß von Energie-regenerierendem und Ran-System auf die Translokation von rC(myr in die Kerne permeabilisierter HeLa-Zellen 120
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   4.2.4 Einfluß des Retikulozytenextraktes auf die Translokation von rC(myr in die Kerne permeabilisierter HeLa-Zellen 122
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   4.2.5 Einfluß der Importin (-Mutante (45-462) auf die Translokation von rC(myr in die Kerne permeabilisierter HeLa-Zellen 124
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  Untersuchungen zur Retention von rC(myr in Kern und Cytoplasma 126
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  5.1 Einfluß der Bindung von rC(myr zu den R-Untereinheiten in Mikroinjektionsexperi-menten und Import-Assays 126
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   5.1.1 Die R-bindungsdefiziente C(-Doppelmutante rC(myr (H87Q/W196R) 126
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   5.1.2 Vergleich der Import-Kinetiken von rC(myr und rC(myr (H87Q/W196R) im Mikroinjektionsexperiment und im Import-Assay 129
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   5.1.3 Das AKAP Ht-31-Inhibitorpeptid 131
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   5.1.4 Einfluß von cAMP auf die intrazelluläre Verteilung von rC(myr in Vero-Zellen 133
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   5.1.5 Sättigungskinetik 135
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   5.2 Depletion von Retikulozytenextrakt mit rC(myr 137
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  5.3 Indirekte Immunfluoreszenzuntersuchungen zur zellulären Lokalisation der R-Untereinheiten und PKI 139
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   5.3.1 Vorkommen und Lokalisation der R-Untereinheiten 139
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   5.3.2 Vorkommen und Lokalisation von PKI 140
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   1 Der Mechanismus der Kern-Cytoplasma-Translokation der C(-Untereinheit: Diffusion oder aktiver Transport? 144
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   2 Die intrazelluläre Verteilung der C(-Untereinheit: Einfluß durch Retention? 159
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   3 Das Modell der Kern-Cytoplasma-Translokation der C(-Untereinheit 168
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   Ausblick 172
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   1 Primer 185
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   2 Peptidsequenzen 186
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   PKA C(-DNA- und Proteinsequenz 187
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   Vektoren 188
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   PCR-Programme 189
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   6 Abkürzungsverzeichnis 190
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   Zusammenfassung
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  Material und Methoden
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  Material
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   Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
•  
   Peptide
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   Mikrobiologische Methoden
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   Transformation / Cotransformation
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  Molekularbiologische Methoden
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  Aufreinigung von DNA
•  
   Plasmidpräparation (Minipräparation)
•  
   Extraktion von DNA aus Agarosegelen
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   Reinigung von PCR-Produkten
•  
   Agarose-Gelelektrophorese
•  
   Konzentrationsbestimmung der DNA
•  
  Klonierung
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   Restriktionsspaltung von DNA
•  
   3.4.2 DNA-Dephosphorylierung
•  
   3.4.3 Ligation von DNA-Fragmenten
•  
  3.5 Mutagenesen
•  
   3.5.1 Mutagenese mit dem QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit
•  
   3.5.2 PCR
•  
   3.6 DNA-Sequenzierung
•  
  Proteinbiochemische Methoden
•  
   Expression rekombinanter Proteine
•  
  Präparation rekombinanter Proteine
•  
   Bakterienzell-Aufschluß
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  4.2.2 Aufreinigung der C-Untereinheit der PKA über PKI (5-24)-Affinitätschromatographie
•  
   Herstellung von PKI (5-24)-Affinitätssäulenmaterial
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   PKI (5-24)-Affinitätschromatographie
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   4.2.3 Aufreinigung der GST-Fusionsproteine über Glutathion-Affinitätschromatographie
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   4.2.4 Nachreinigung der C-Untereinheit der PKA durch Mono-S-Ionenaustauscher-Chromatographie
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   Konzentrieren und Umpuffern von Proteinen
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   Bestimmung der Proteinkonzentration
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   SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
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   Transfer von Proteinen auf PVDF-Membranen (Western Blot)
•  
   Isoelektrische Fokussierung
•  
   Gelfiltration
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   Bestimmung der Kinase-Aktivität
•  
   Konjugation von Fluoreszenzfarbstoffen an Proteine
•  
   Massenspektrometrische Untersuchungen
•  
  Mikroinjektion von Proteinen in Zellkulturzellen
•  
   Kultivierung und Handhabung der Zellen für die Mikroinjektionsexperimente
•  
   Kapillaren
•  
   Injektionsproben
•  
   Mikroinjektion mit dem halbautomatischen System von Eppendorf
•  
   Inkubation der injizierten Zellen
•  
   Konservierung der Präparate
•  
   Detektion und Auswertung
•  
   Indirekte Immunfluoreszenz
•  
   Importkinetik / Import Assay
•  
   Depletion
•  
   Diskussion
•  
   Der Mechanismus der Kern-Cytoplasma-Translokation der C(-Untereinheit: Diffusion oder aktiver Transport?
•  
   Die intrazelluläre Verteilung der C(-Untereinheit: Einfluß durch Retention?
•  
   3 Das Modell der Kern-Cytoplasma-Translokation der C(-Untereinheit
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   Ausblick
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   Literaturverzeichnis
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  Anhang
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   Primer
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   2 Peptidsequenzen
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   PKA C(-DNA- und Proteinsequenz
•  
   Vektoren
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   PCR-Programme
•  
   6 Abkürzungsverzeichnis
•  
   Danksagung
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   Lebenslauf