Inhalt

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   Erklärung
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   Inhaltsverzeichnis
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   Kurzfassung
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   Abstract
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  Einleitung
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   Die Alzheimer-Krankheit
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   Amyloid Plaques und A Toxizität
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   Das Zelladhäsionsmolekül APP
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  Prozessierung von APP
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   Der nicht-amyloidogene Weg
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   Der amyloidogene Weg
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   Mutationen des Amyloid Precursor Proteins
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   -Sekretase
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   -Sekretase
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   Presenilin
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   Nicastrin
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   Aph-1 und Pen-2
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   Das Zelladhäsionsmolekül L1
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   APP-Bindepartner
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   Kreatinkinase
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   Calretikulin
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  Proteasen
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   Metzinkine
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   ADAMs
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   MMPs
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   Aufgabenstellung
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  Material
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   Allgemeine Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
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   Reaktionskits und Enzyme
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   Antibiotika
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   Detergenzien
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   Inhibitoren
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   Zelllinien
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   Basiszelllinien
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   Stabil transfizierte Zelllinien
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   Kultivierung und Langzeitlagerung von Zellen
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   Kultivierung
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   Langzeitlagerung
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   E.coli-Stämme
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  Stammhaltung und Kultivierung von E.coli
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   Stammhaltung
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   Kultivierung
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   Vektoren
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   Expressionskonstrukte
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  Antikörper
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   Primärantikörper
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   Sekundärantikörper
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   Metalloproteasen
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   Peptide
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   GST-Proteine
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   Molekulargewicht-Standards
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   Häufig verwendete Lösungen und Puffer
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  Methoden
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  Biochemische Methoden
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   Eindimensionale SDS-PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
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   Trizin-SDS-PAGE
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   Zymographie
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  SDS-Gelfärbung
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   Coomassie-Färbung
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   Silberfärbung
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  Immunoblot-Analyse
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   Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose-Membranen
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   Immunreaktion
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   ECL-Reaktion
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   Proteinfällung
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   Proteinfällung nach Wessel
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   Acetonfällung
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   Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration (BCA-Test)
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   Zellfraktionierung
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   Herstellung eines Mausgehirn-Homogenates
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   Herstellung der löslichen Fraktion S1 und des „17000 g“ - Sedimentes3 aus Mausgehirn-Homogenat
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   Isolierung von Fraktionen, angereichert mit Synaptosomen, Myelin, Axolemma und Mitochondrien
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   Lösen von Membranbestandteilen
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  Aufreinigung des anti-D-Antikörpers
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   Isolierung des anti-D-IgG mit Hilfe des DEAE Kit (Bio-Rad)
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   Isolierung des anti-D-IgG durch Protein A
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   Konzentration einer Probe
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  Herstellung einer Säule für die Affinitätschromatographie
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   Kopplung des anti-D IgG an die Matrix einer CarboLink Säule
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   Kopplung des anti-D-IgG an CNBr-aktivierte Sepharose-4B
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   Affinitätschromatographie
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   Probenvorbereitung für die Sequenzanalyse
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   Immunpräzipitation
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   Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
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   Aufreinigung der GST-Proteine
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   pulldown-Untersuchung
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   -Sekretasekomplex Isolierung
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   -Sekretase Aktivitätsbestimmung
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   in vitro -Sekretaseaktivitätsuntersuchung
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   Oberflächenbiotinylierung
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  in vitro-Spaltexperimente
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   ADAM-vermittelte Spaltung von Fc-Proteinen
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   Aktivierung von MMP-2
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   MMP-vermittelte Spaltung von Fc-Proteinen
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  Molekularbiologische Methoden
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   PCR
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   Aufreinigung von PCR-Produkten
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   Restriktionsverdau
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   Gelelektrophoretische Auftrennung von DNS
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   Ligation von DNS
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   Transformation von Bakterien
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   Minipräparation von Plasmid-DNS aus E.coli-Bakterienkulturen
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   Maxipräparation von Plasmid-DNS aus E.coli-Bakterienkulturen
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   DNS-Isolation aus Agarosegelen
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   DNS-Reinheitsanalyse und -Konzentrationsbestimmung
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   DNS-Sequenzierung
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  Zellbiologische Methoden
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  Transiente Transfektion
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   Transfektion mit Lipofektamin
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   Transfektion mit FuGENE
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   Magnet Assisted Transfection (MATra)
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   Aufarbeitung von Zellen und Zellkulturüberständen
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   Durchflusszytometrie
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  Primärzellkultur
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   Beschichtung von Deckgläschen mit poly-L-Lysin (PLL)
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   Einzelzellkulturen von hippocampalen Neuronen
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   Immunhistochemie
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  Theoretische Analyse
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  Komplementäre Hydropathie
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   Kyte-Doolittle Hydropathie-Profil
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   Theorie der molekularen Grundlage komplementärer Peptidinteraktionen
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   Sequenzanalyse
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  Ergebnisse
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   Identifikation APP-bindender Proteine
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  Studie 1: Identifizierung neuer Bindepartner der APP -Spaltstelle
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   Charakterisierung der anti-D-Antikörper
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   Expression von APP in den verschieden Gehirnfraktionen
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   Charakterisierung der vom anti-D-IgG erkannten Proteine
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   Affinitätschromatographie
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   Sequenzanalyse der ausgeschnittenen Proteinbanden
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   Überprüfen des Vorkommens der identifizierten Proteine in den, durch die Affinitätschromatographie erhaltenen, Elutionsfraktionen
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   Überprüfen einer möglichen Interaktion der identifizierten Proteine und APP mittels Co-Immunpräzipitation
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   Überprüfen einer Bindung der Na+-/K+-ATPase und APP mittels ELISA
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   Überprüfen einer Bindung der möglichen APP-Bindepartner und Presenilin mittels Co-Immunpräzipitation
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  Studie 2: Charakterisierung der Interaktion von APP und der CK-B
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   Co-Immunpräzipitation der Kreatinkinase-B und APP
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   Oberflächenbiotinylierung
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  Studie 3: Charakterisierung der Interaktion von CRT und APP hinsichtlich APP--Spaltung
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   Bestätigung der Bindung von CRT und APP mittels Co-Immunpräzipitation
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   Überprüfen einer Bindung von CRT und C99-APP mittels Co-Immunpräzipitation
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   Charakterisierung der Bindung von CRT und C99-APP durch Pulldown-Untersuchungen
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   Überprüfen einer Bindung von CRT und PS1 durch Co-Immunpräzipitation
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   Bestätigung einer Interaktion von APP, CRT und PS1 mittels Co-Lokalisations-Experimenten
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   Charakterisierung der Bindung von CRT und PS1 durch pulldownUntersuchungen
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   Isolierung des -Sekretasekomplexes
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   Aufreinigung der -Sekretase in vier Schritten
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   Überprüfen einer Bindung von CRT und NCT, APH-1 sowie PEN-2 mittels Co-Immunpräzipitation
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   Charakterisierung der Interaktion von CRT und NCT durch Pulldown-Untersuchungen
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  Analyse eines Einflusses von CRT auf die -Spaltung von APP
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   Analyse der Zelloberflächenkonzentration von APP mittels Oberflächenbiotinylierung
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   Analyse der Zelloberflächenkonzentration von APP mittels Durchflusszytometrie
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   -Sekretase-Aktivitätsbestimmung mittels ELISA
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   in vitro--Sekretase-Aktivitätsuntersuchung
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   Analyse des PS1-Einflusses auf CRT
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   Überprüfen einer Interaktion von CRT und L1 mittels Co-Immunpräzipitation
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   Charakterisierung der Interaktion von CRT und L1 mittels Co-Immunpräzipitation
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   Analyse eines CRT-Einflussses auf die Expression und Lokalisation von L1
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  Prozessierung der Zelladhäsionsmoleküle APP und L1
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   ADAM vermittelte Spaltung
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   Gelatinasespaltung
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  Diskussion
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   Diskussion der möglichen Bindepartner von APP und der daraus ersichtlichen Funktionen
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   Kreatinkinase-B: ein APP-Bindepartner? - Kritische Einschätzung der angewandten Methoden
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   Charakterisierung der Interaktion von APP und CRT
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   Metalloprotease-vermittelte Spaltung der Zelladhäsionsmoleküle APP und L1
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   Allgemeine Einschätzung der Ergebnisse
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   Literatur
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   Anhang A Akzessionsnummer
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   Anhang B Oligonukleotide
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  Anhang C Plasmide
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   L1-30kDa
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   L1-ICD
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   Abkürzungsverzeichnis
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   Abbildungsverzeichnis
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   Tabellenverzeichnis
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   Danksagung