Hackmann, Karl: Untersuchungen zur Expression der murinen Gene Pkd1 und Pkd2, den orthologen Genen der Autosomal Dominanten Polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD). 2005
Inhalt
- 1 Einleitung
- 1.1 Die Autosomal Dominante Polyzystische Nierenkrankheit (A
- 1.2 Das PKD1- Gen
- 1.3 Das PKD2- Gen
- 1.4 ADPKD und primäre Cilien
- 1.5 Polycystin- verwandte Proteine
- 1.6 Tiermodelle Polyzystischer Nierenerkrankungen
- 1.6.1 Mutagenese des murinen Pkd1- Gens
- 1.6.2 Mutagenese des murinen Pkd2- Gens
- 1.6.3 Tiermodelle mit unbekannter genetischer Ursache
- 1.6.4 Tiermodelle der Autosomal Rezessiven Polyzystischen Ni
- Ziele dieser Arbeit
- 2 Material und Methoden
- 2.1 Bezugsfirmen
- 2.2 Geräte
- 2.3 Kultivierung von Escherichia coli-Kulturen
- 2.3.1 Das LacZ-Gen als Selektionsmarker
- 2.3.2 Das ccd-Gen in pZErO als Selektionsmarker
- 2.3.3 Verwendete Escherichia coli Bakterienstämme
- 2.3.4 Gefrierkulturen von E. coli
- 2.3.5 Elektrokompetente Zellen
- 2.3.6 Transformation von DNA in Bakterien
- 2.3.6.1 Elektroporation
- 2.3.6.2 Transformation chemisch kompetenter Bakterien
- 2.3.7 „ET-Cloning“
- 2.3.8 Elektrokompetente Zellen für das „ET-Cloning“
- 2.3.9 Plasmidvektoren
- 2.4 DNA Isolierung
- 2.4.1 Plasmidpräparation (Miniprep)
- 2.4.2 Plasmidpräparationen mit Ionenaustauschersäulen
- 2.4.3 DNA Isolierung aus Gewebeproben/ Phenol-Chloroform-Fäl
- 2.4.4 DNA-Fällung mit Ethanol
- 2.4.5 DNA-Fällung mit Isopropanol
- 2.5 RNA-Isolierung aus Gewebeproben und Zellkulturen
- 2.6 Konzentrationsbestimmungen von Nukleinsäuren
- 2.7 Gelelektrophorese von DNA Fragmenten
- 2.8 Southern Transfer (Southern Blot)
- 2.9 DNA-DNA-Hybridisierung
- 2.9.1 Radioaktive DNA-Sonden
- 2.9.2 Nicht-radioaktive DNA-Sonden
- 2.9.3 Radioaktive Hybridisierung
- 2.9.4 Nichtradioaktive Hybridisierung
- 2.10 Enzymatische Behandlung von Nukleinsäuren
- 2.10.1 DNA-Restriktion
- 2.10.2 Dephosphorylierung von 5’-Enden
- 2.10.3 Auffüllen von 5’-Überhängen mit Klenow-Enzym
- 2.10.4 Ligation von DNA-Fragmenten
- 2.10.5 Klonierung von PCR-Produkten
- 2.11 Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, P
- 2.12 Reverse Transkription von RNA
- 2.13 DNA-Sequenzierung
- 2.14 Quantitative PCR
- 2.15 Zellkultur
- 2.15.1 Einfrieren der Zellen
- 2.15.2 Auftauen der Zellen
- 2.15.3 Isolierung translatierter RNA aus membrangebundenen P
- 2.15.4 Transfektionen
- 2.15.5 Immunofluoreszenz von HeLa-Zellen
- 2.15.6 Immunopräzipitation der Polycystine (nach Hanaoka et
- 2.16 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
- 2.17 Proteintransfer auf Membranen (Western Blot)
- 2.18 Tierhaltung
- 2.19 Erzeugung transgener Mäuse
- 2.20 Immunhistologische Untersuchungen an Embryosektionen vo
- 3 Ergebnisse (Teil 1)
- Erzeugung von Transgenen Pkd1 Mauslinien
- 3.1 Immunhistologische Untersuchungen an Mausembryonen
- 3.2 Screening einer murinen, genomischen DNA-Bank auf Pkd 1-
- 3.2.1 Subklonierung und partielle Sequenzierung des BACs 423
- 3.3 Konstruktion eines genomischen Pkd1-Fragments mit Marker
- 3.4 Test der transgenen Konstrukte im Zellkulturexperiment
- 3.5 Analyse der Transgenen Mäuse
- 4 Ergebnisse (Teil 2)
- Spleißvarianten der humanen PKD2-und des murinen Pkd2-Gens
- 4.1 Alternative Transkripte des humanen PKD2-und des murinen
- 4.1.1 Amplifikation des codierenden Bereichs des PKD2/ Pkd2-
- 4.1.2 Spleißvarianten des murinen und humanen PDK2/ Pkd2
- 4.1.3 PKD2∆6 und Pkd2∆6
- 4.1.4 PKD2∆7 und Pkd2∆7
- 4.1.5 PKD2∆9 und Pkd2∆9
- 4.1.6 PKD2 ∆12-13 und Pkd2∆12-13
- 4.2 Charakterisierung der PKD2/ Pkd2∆7 Spleißvarianten
- 4.2.1 Nachweis der PKD2∆7-Spleißvariante in membrangebundene
- 4.2.2 Die Pkd2∆7-Spleißvariante in verschiedenen Geweben
- 4.2.3 Quantitative Charakterisierung der Pkd2-und Pkd2∆7-Tra
- 4.2.4 Quantifizierung der Pkd2-und Pkd2∆7-Expression am Embr
- 4.2.5 Quantifizierung der Pkd2-und Pkd2∆7-Expression in neug
- 4.2.6 Quantifizierung der Pkd2-und Pkd2∆7-Expression in adul
- 4.3 Zellkulturexperimente mit Pkd2, Pkd2∆7
- 4.3.1 Fusionsproteine in „Living-Color“-Vektoren
- 4.3.2 Antikörper gegen Polycystin-2 und Polycystin-2∆7
- 4.3.3 (Co-) Immunopräzipitationsexperimente
- 4.4 Computergestützte Analyse der PKD2/ Pkd2∆7-Varianten
- 5 Diskussion (Teil 1)
- 6 Diskussion (Teil 2)
- 6.1 Alternative Spleißformen der Pkd2/PKD2-Transkripte
- 6.2 Kritische Betrachtung der Zellkulturexperimente
- 6.3 Spleißformen der Polycystin-ähnlichen Gene und der NMD-S
- 6.4 Funktionelle Relevanz von PKD2∆7/Pkd2∆7 und PKD2∆12-13/P
- 7 Literaturverzeichnis
- 8 Anhang
- 9 Zusammenfassung