Inhalt

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   1 Zusammenfassung
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  2 Einleitung
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   2.1 Posttranskriptionelle Genregulation durch miRNAs
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   2.1.1 Historie der RNAi-Forschung
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   2.1.2 Biogenese von miRNAs im Menschen und in der Maus
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   2.1.3 Mechanismus der miRNA-vermittelten posttranskriptionellen Genregulation
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   2.1.4 Mechanismus der Zielgenerkennung
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   2.1.5 Computergestützte Vorhersagen von miRNA-Zielgenen
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   2.1.6 Das Vorhersageprogramm RNAhybrid
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   2.1.7 Einfluss einer miRNA-vermittelten Genregulation
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   2.1.8 Bekannte Funktionen von miRNAs
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   2.2 Die Wobbler-Maus
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   2.3 Ziele dieser Arbeit
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  3 Material und Methoden
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  3.1 Material
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   3.1.1 Bakterienstämme
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   3.1.2 Zelllinien
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   3.1.3 Mausstämme
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   3.1.4 Vektoren
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   3.1.5 Oligonukleotide
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  3.1.6 Kulturmedien
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   3.1.6.1 Kulturmedien für Bakterien
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   3.1.6.2 Zellkulturmedien
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   3.1.7 Antibiotika
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   3.1.8 DNA-Längenstandards
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   3.1.9 Enzyme
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   3.1.10 Kits
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   3.1.11 Chemikalien
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   3.1.12 Antikörper
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   3.1.13 In silico Ressourcen
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   3.1.14 Bezugsquellen
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  3.2 DNA-Methoden
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   3.2.1 Handhabung rekombinanter Bakterien
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   3.2.2 Transformation von Bakterien
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   3.2.3 Herstellung chemisch kompetenter Zellen
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   3.2.4 Agarosegelelektrophorese
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  3.2.5 Plasmidisolierung aus Bakterien
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   3.2.5.1 Easy Präp
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   3.2.5.2 Alkalische Lyse
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   3.2.5.3 Plasmid-DNA-Isolierung aus Bakterien mittels Ionenaustauschersäulen
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   3.2.5.4 Endotoxinfreie Plasmidisolierung
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   3.2.6 DNA-Isolierung aus Mausgewebe
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   3.2.7 Schnellpräparation von DNA aus Mausschwanzspitzen
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   3.2.8 DNA-Isolierung aus Agarosegelen
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   3.2.9 Aufreinigung von PCR-Produkten
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   3.2.10 Quantifizierung von Nucleinsäuren
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   3.2.11 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
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   3.2.11.1 Gradienten-PCR
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   3.2.11.2 Verwendung einer Proofreading-Polymeras
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   3.2.11.3 Kolonie-PCR
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   3.2.12 Klonierung von PCR-Produken
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   3.2.13 Restriktionsspaltung von DNA
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   3.2.14 DNA-Ligationen
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   3.2.15 Aufreinigung und Ankonzentrierung von DNA
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   3.2.16 Transfer von DNA auf Membranen (Southern-Blot)
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   3.2.17 Herstellung von radioaktiven Sonden (Random Priming)
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   3.2.18 Hybridisierung und Detektion von Southern Blots
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  3.3 RNA-Methoden
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   3.3.1 RNA-Isolierung (total-RNA Präparation)
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   3.3.2 Transfer von RNA auf Membranen (Northern Blot)
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   3.3.3 Radioaktive Markierung von Oligonukleotid-Sonden am 5´Ende
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   3.3.4 Hybridisierung und Detektion von Northern Blots
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   3.3.5 Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)
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   3.3.6 Quantitative Realtime-PCR (qRT-PCR)
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  3.3.7 5`RACE
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   3.3.7.1 5´RACE mit Hilfe des Systems von Roche
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   3.3.7.2 5´RACE mit Hilfe einer Adapterligation
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   3.4 Zellkulturmethoden
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   3.4.1 Kultivierung von Zellen
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   3.4.2 Langzeit-Lagerung von Zellen
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   3.4.3 Transiente Transfektion
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   3.4.4 Erzeugung einer Zelllinie mit stabiler Integrationen des Gens EGFP
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  3.5 Proteinbiochemische Methoden
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   3.5.1 Proteinisolierung
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   3.5.2 Protein-Konzentrationsbestimmung
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   3.5.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
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   3.5.4 Coomassie-Färbung
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   3.5.5 Transfer von Proteinen auf eine Membran (Western-Blot)
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   3.5.6 Immundetektion
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   3.5.7 Immunblot-Stripping
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   3.6 Präparation von Mausgeweben für in situ Hybridisierungen
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   3.7 Dual-Luciferase-Reporter-Assay-System
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  4 Ergebnisse
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  4.1 Vorhersage von miRNA-Zielgen-Interaktionen
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   4.1.1 Sequenzdaten-Beschaffung
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   4.1.2 Festlegen der Suchparameter
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   4.1.3 Poisson-Statistik
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   4.1.4 Orthologie-Vergleich
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  4.2 Validierung von vorhergesagten miRNA-Zielgen-Interaktionen
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   4.2.1 Etablierung des Testsystems
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   4.2.2 Validierung von Vorhersagen aus der Kategorie „klassische Vorhersage“
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   4.2.3 Validierung von Vorhersagen aus der Kategorie „G:U-zulassen“
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   4.2.4 Validierung von Vorhersagen aus der Kategorie „freie Vorhersage“
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   4.3 Charakterisierung der Interaktion der miRNA-17-3p und dem Gen Vimentin
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   4.3.1 Validierung der inhibitorischen Wirkung der miRNA-17-3p durch die Interaktion mit der vorhergesagten Zielsequenz
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   4.3.2 Nachweis der Inhibition des nativen Gens in vivo
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   4.3.3 Untersuchung der miRNA-17-3p-Wirkung auf mRNA von Vimentin
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   4.4 Verknüpfung der miR17-3p:Vimentin-Interaktion mit der Wobbler-Maus
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   4.4.1 Vergleichende in situ Hybridisierungen der miR-17-3p im Rückenmark von Wobbler- und Wildtyp-Mäusen
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   4.4.2 Auswirkung der differenziellen Vimentin-Expression auf den Phänotyp der Wobbler-Maus
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   4.4.3 Vergleichende Expressionsuntersuchung von miRNAs mittels miRNA-Microarray
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   4.5 Charakterisierung der Expression und Funktion der miRNA-138
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   4.5.1 Erzeugung einer Mauslinie mit einem Null-Allel für miRNA-138
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   4.5.2 Reannotation der exakten miRNA-138 Sequenz
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  5 Diskussion
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   5.1 miRNA-Zielgenvorhersage
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   5.1.1 Verbesserung der Sequenzdatenqualität zur Steigerung der Spezifität und Sensitivität der Zielgenvorhersage
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   5.1.2 Validierung von miRNA-Zielgen-Interaktionen der Kategorie „klassische Vorhersage“
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   5.1.3 Validierung von miRNA-Zielgen-Interaktionen der Kategorien „G:U zulassen“ und „freie Vorhersage“
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   5.1.4 Bewertung der Daten und des Testsystems
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   5.1.5 Evaluation des Algorithmus
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  5.1.6 Mögliche Funktionen der validierten Interaktionen
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   5.1.6.1 Ptdsr:miR-96
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   5.1.6.2 FutIV-miR-412
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   5.1.6.3 Mapk7:miR-143
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   5.1.6.4 Isl2:miR-375
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   5.1.6.5 Plk2:miR-27b
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   5.1.6.6 Vim:miR-17-3p
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  5.2 Charakterisierung und Funktionsanalyse von miRNAs
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   5.2.1 Charakterisierung der miR-138
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   5.2.2 Einfluss von Vimentin in der Wobbler-Maus
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   5.2.3 Einfluss von miRNAs bei des Ausprägung des Wobbler-Phänotyps
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   5.3 Ausblick
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   6 Literatur
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  7 Anhang
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   7.1 Daten der Gewichts und Kraftmessungen
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   7.2 Vergleichende Sequenzanalyse des murinen Trpc3-Gens
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   7.3 Hybridisierungsstrukturen der analysierten miRNA-Zielgen-Interaktionen
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   7.4 Abkürzungsverzeichnis
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   7.5 Danksagung
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   7.6 Erklärung