Schwarzer, Christian: Expression von humanem Typ-1-Porin in Xenopus-Oozyten und Studien zu seiner Funktionalität. 2000
Inhalt
- Einleitung
- Material
- Bakterienstämme
- Eukaryontische Zellen
- Tiere
- Nährmedien
- Medien für Bakterienkulturen
- Medien für Hefekulturen
- Medien für Zellkulturen
- Medien für Xenopus laevis Oozyten
- Lösungen und Puffer
- Plasmide
- Oligodesoxyribonukleotide
- Oligonukleotid-Primer für Nukleotidsequenzanalysen
- Oligonukleotid-Primer für Polymerase-Kettenreaktionen und Nukleotidsequenzanalysen
- Enzyme, Nukleinsäuren und Antikörper
- Chemikalien, Feinmaterialien und Kits
- Geräte
- Methoden
- Allgemeine molekularbiologische Methoden
- Synthese von Oligonukleotiden
- Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
- Polymerase-Kettenreaktion
- Reinigung von PCR-Produkten
- Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
- Agarose-Gelelektrophorese
- Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
- Ligation
- Klonierung von DNA-Fragmenten
- Kultivierung und Konservierung von E. coli
- Transformation von E. coli
- Isolierung von Plasmid-DNA
- DNA-Sequenzanalyse
- Sequenzierung von DNA mit dem A.L.F.-Sequenziergerät
- Sequenzierung von DNA mit dem ABI PrismTM 377-Sequenziergerät
- In vitro-Transkription
- Denaturierende Gelelektrophorese von RNA
- In vitro-Translation
- Methoden für das Two-Hybrid System
- mRNA Isolierung aus H2LCL-Zellen
- cDNA-Synthese
- Synthese einer pMyr-cDNA Bank
- Kultivierung der Hefezellen
- Präparation kompetenter Hefezellen
- Transformation kompetenter Zellen
- Durchmusterung der H2LCL cDNA-Bank im Cyto-TrapTM Two-Hybrid System
- Präparation von Plasmid-DNA aus Hefezellen
- Allgemeine proteinchemische Methoden
- Azeton-Fällung
- Trichloressigsäure-Fällung
- SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
- Proteintransfer auf PVDF-Membranen
- Immunologische Detektion von Proteinen auf PVDF-Membranen
- Enzymatische Detektion biotinylierter Proteine auf PVDF-Membranen
- Methoden zur Expression und Isolierung rekombinanter Proteine
- Präparation von E. coli BL21 (DE3) pLys [pGEX-Tctex1 oder pGEX-(PBP74]-Gesamtzellextrakten
- Isolierung von rekombinantem Tctex1 und (PBP74
- Überlagerungsassay
- Versuche mit künstlichen Lipid-Doppelmembranen
- Zellbiologische Techniken
- Ergebnisse
- Heterologe Expression von hVDAC1 in Xenopus laevis Oozyten
- Konstruktion der hVDAC1-Plasmide
- In vitro-Transkription und Translation
- Plasmalemmale Lokalisierung der heterolog exprimierten Proteine
- Biochemische Analyse heterolog exprimierter hVDAC1-Konstrukte
- Elekrophysiologische Messungen an Xenopus Oozyten
- Nachweis von hVDAC1-Interaktionspartnern im Two-Hybrid System
- Konstruktion der H2LCL-cDNA Bank im Vektor pMyr
- Konstruktion des pSos-Vektors mit hVDAC1
- Überprüfung der hVDAC1-Wirkung auf das temperatursensitive Zellwachstum
- Interaktions-Assay
- Identifizierung der mit hVDAC1 interagierenden Proteine
- Bestätigung der Bindungsspezifität der interagierenden Proteine
- Proteinchemische Verifizierung der ermittelten Protein/Protein-Interaktionen
- Expression und Aufreinigung von rekombinantem Tctex1
- In vitro-Assoziation von hVDAC1 und Tctex1 im Überlagerungsassay
- Expression und Aufreinigung von rekombinantem (PBP74
- In vitro-Assoziation von hVDAC1 und (PBP74 im Überlagerungsassay
- Lokalisierungsstudien der interagierenden Proteine in HeLa-Zellen
- Kolokalisierung von hVDAC1 mit Tctex1
- Kolokalisierung von hVDAC1 mit PBP74
- Lokalisierung von hVDAC1 in Hela-Zellen
- Funktionelle Auswirkung der Interaktionspartner auf hVDAC1
- Diskussion
- VDAC im Kontext der Mitochondrien und der Plasmamembran
- Heterologe Expression in Xenopus laevis Oozyten
- Fluoreszenzmikroskopische Befunde zur Expression von hVDAC1 in der Zellmembran von Xenopus Oozyten
- Elektronenmikroskopische Befunde zur Expression von hVDAC1 in der Zellmembran von Xenopus Oozyten
- Biochemische Bestätigung der heterolog exprimierten Proteine
- Voltage clamp Messungen an Xenopus Oozyten
- VDAC im Kontext von Anionen-Kanälen an der Plasmamembran
- Nachweis von hVDAC1-bindenden Proteinen mit Hilfe des Two-Hybrid Systems
- Stand der Translokation und Lokalisierung von VDAC1
- Stand der Diskussion zur Funktion von VDAC1
- Ausblick
- Zusammenfassung
- Abkürzungsverzeichnis
- Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen
- Literaturverzeichnis