Friehs, Karl: Maßnahmen zur Verbesserung der Produktion von rekombinanten Proteinen und Plasmid-DNS. 1999
Inhalt
- Einführung
- Theoretische Grundlagen
- Gentechnische Methoden im Überblick
- Vektoren für E. coli
- Genquellen
- Übertragungsmechanismen für Plasmidvektoren
- Selektion und Analyse von Klonen
- Maßnahmen auf Ebene der DNS
- Maßnahmen auf der Ebene der Transkription und Translation
- Promotoren: Stärke und Regulation sowie Terminatoren
- Promotorstärke
- Regulation von Promotoren
- Artspezifität und Kompatibilität von Promotoren
- Promotoren für die Fermentationstechnik
- Terminatoren
- Boten˚RNS (mRNS) und ribosomale Bindungsstelle
- Start˚Codon, Stop˚Codon, Codon˚Präferenz und Leserahmen
- Maßnahmen auf Ebene der Proteine
- Proteolyse und ihre Reduzierung
- Reduzierung der Proteolyse durch Beeinflussung der Proteasenaktivität
- Reduzierung der Proteolyse durch Änderungen am rekombinanten Protein
- Reduzierung der Proteolyse während der Aufarbeitung
- Proteinfaltung
- Posttranslationale Modifikation
- Produktheterogenität
- Maßnahmen zur Lokalisierung rekombinanter Produkte
- Lokalisierung rekombinanter Proteine in Escherichia coli
- Sekretionstypen in Gram˚negativen Bakterien
- Maßnahmen für den Transport rekombinanter Proteine in das Periplasma von E. coli
- Maßnahmen über die Signalsequenz
- Co˚Expression von Sec˚Proteinen
- Beeinflussung der Faltung im Periplasma
- Verankerung von rekombinanten Proteinen an der äußern Membran
- Maßnahmen zur Sekretion bzw. zum Export rekombinanter Proteine in das Medium von E. coli
- Maßnahmen zur Verbesserung der Aufarbeitung
- Experimente und Diskussion
- Plasmidkopienzahl: Bestimmung und Beeinflussung
- Quantifizierung von Plasmid-DNS
- Bestimmung der Plasmidkopienzahl mittels Agarosegelelektrophorese
- Direkte Densitometrie von Agarosegelen
- Densitometrie der Fotonegative von Agarosegelen
- Einflüsse bei der Bestimmung der Plasmidkopienzahl mittels Agarosegelelektrophorese
- Bestimmung der Plasmidkopienzahl mittels Kapillarelektrophorese
- Kapillarelektrophorese von Plasmid-DNS
- Plasmidquantifizierung mit Kapillarelektrophorese u. YOYO
- Vergleich von Plasmidisolierungsmethoden
- Optimierung der DNS-Quantifizierung mittels Kapillargelelektrophorese
- Erhöhung der Plasmidkopienzahl durch Runaway-replication
- Strukturelle und segregative Plasmidstabilität
- Strukturelle Instabilität beim Plasmid pJMC40
- Segregative Plasmidstabilität und ihre Bestimmung in der Praxis
- Segregative Stabilisierung von Plasmiden über Selektionsdruck
- Segregative Stabilisierung über eine spezielle genetische Funktion (par)
- Segregative Plasmidstabilität durch hohe Kopienzahl und in einem Mehrplasmid-System
- Einfluß des Mediums auf die segregative Plasmidstabilität
- Plasmidformen: Bedeutung und Analytik
- Plasmidqualität und Qualitätskontrolle
- Identifizierung von Plasmidformen mittels Elektronenmikroskopie
- Zuordnung von Plasmidformen zu Banden in Agarosegelen
- Zuordnung von Plasmidformen zu Signalen der Kapillargelelektrophorese
- Trennung von Plasmidformen
- Zuordnung von Elektropherogrammsignalen zu Plasmidformen
- Vergleich der Mobilitäten von pUC19 in Kapillargelelektrophorese und AGE
- Quantifizierung von Plasmidformen
- Verunreinigungen durch Nukleinsäuren
- Promotoren
- Lokalisierung rekombinanter Produkte
- Klonierung und Lokalisierung der Levanase aus B. subtilis in A. eutrophus
- Co˚Expression von Sec-Proteinen
- Entwicklung und Einsatz eines E.€coli˚Sekretionssystems
- Wirkungsweise des Bacteriocin-Release -Protein bei der Sekretion von Colicinen
- Sekretion heterologer Proteine durch Bacteriocin-Release-Protein
- Expression des kil-Gens unter Stationärphase˚Promotoren
- Sekretion einer (˚Glucanase durch E.€coli bei Anzucht im Bioreaktor
- Entwicklung von Sekretionsstämmen von Klebsiella planticola
- Verbesserung der Aufarbeitung durch Fusionsproteine
- Affinitätschromatographie mit SpA als Fusionskomplement
- Konstruktion eines Hisactophilin-GFP Fusionsproteins
- Entsorgung und Verwertung von Mikroorganismen
- Schlußbetrachtung
- Literaturverzeichnis
- Abkürzungen & Symbole