Bauwens, Andreas: Zelluläre Funktionsstudien zum Wirkungsmechanismus von Shiga Toxinen bei mikro- und makrovaskulären Endothelzelllinien. 2010
Inhalt
- 1 VORBEMERKUNGEN
- 2 INHALTSVERZEICHNIS1 Vorbemerkunge
- 3 THEORETISCHER HINTERGRUND
- 3.1 Enterohämorrhagische Escherichia coli
- 3.1.1 Historie und Nomenklatur
- 3.1.2 Serotypen
- 3.1.3 Reservoir und Transmission von EHEC
- 3.1.4 Pathogenese und Pathomechanismen der EHEC-Infektion
- 3.2 Shiga Toxin-unabhängige EHEC-Virulenzfaktoren
- 3.2.1 EHEC-Adhäsine
- 3.2.2 EHEC-Toxine
- 3.2.2.1 Das cytolethal distending toxin
- 3.2.2.2 Das EHEC-Hämolysin
- 3.2.2.3 Das Subtilase Zytotoxin
- 3.2.2.4 Das EHEC vakuolisierende Toxin
- 3.2.3 EHEC-Serinproteasen
- 3.3 Shiga Toxine
- 3.3.1 Aufbau und Struktur
- 3.3.2 Der zelluläre Rezeptor Globotriaosylceramid
- 3.3.3 Internalisierung und Prozessierung
- 3.3.4 Wirkungsmechanismen von Shiga Toxinen
- 3.4 Endothelzellen
- 3.5 Zielsetzung
- 4 MATERIAL UND METHODEN
- 4.1 Chemikalien
- 4.2 Geräte
- 4.3 Toxine
- 4.4 Zellkultivierung
- 4.5 Handhabung der Zellen
- 4.5.1 Kalzium- und magnesiumfreie, phosphatgepufferte Salinelösung
- 4.5.2 Kulturmedien
- 4.5.3 Passagierung von Zellen
- 4.5.4 Kryokonservierung von Zellen
- 4.6 offline-Analytik von Kultivierungsprozessen
- 4.7 Zellbasierte Assays
- 4.7.1 Proliferationsassay WST-1
- 4.7.2 Zytotoxizitätsassay nach dem Vorbild des vero cell assays
- 4.7.3 DNA-Fragmentierungsassay
- 4.8 Mikroskopische Techniken
- 4.8.1 Lichtmikroskopie
- 4.8.2 Fluoreszenzmikroskopie
- 4.8.2.1 Antikörper für die Fluoreszenzmikroskopie
- 4.8.2.2 Kopplung von Fluoreszenzfarbstoffen an Proteine
- 4.8.2.3 Vorbereitung des Zellpräparates für die Fluoreszenzmikroskopie
- 4.8.2.4 Das Fluoreszenzmikroskop
- 4.8.3 Digital holographische Mikroskopie
- 4.8.3.1 Präparation der Probe für die digital holographische Mikroskopie
- 4.8.3.2 Das digital holographische Mikroskop
- 4.8.3.3 Datenverarbeitung nach den Messungen
- 4.8.4 Rasterelektronenmikroskopie
- 4.9 Durchflusszytometrie
- 4.9.1 Vorbereitung der Zellen für die durchflusszytometrische Messung von Zellzyklus und Stx-Rezeptordichte
- 4.9.2 Das Durchflusszytometer
- 4.9.3 Datenverarbeitung nach der Durchflusszytometrie-Messung
- 4.10 Elektrische Zell-Substrat Impedanz Messung
- 4.11 Statistische Auswertung
- 5 ERGEBNISSE
- 5.1 Unterschiedliche Wirkungsweisen von Stx1 und Stx2 auf mikro- und makrovaskuläre Endothelzelllinien
- 5.1.1 Toxin-bedingte Wachstumsinhibition von Endothelzellen
- 5.1.2 Unterschiedliche Zytotoxizitäten von Stx gegenüber Endothelzelllinien
- 5.1.3 Morphologische Änderungen von Endothelzelllinien durch Stx
- 5.1.4 Untersuchungen des Toxin-bedingten Zelltodsmittels Einzelzellanalyse
- 5.1.5 Zellzyklusuntersuchungen von Endothelzellen nach Toxinbehandlung
- 5.1.6 Der Unterschied von Stx1 und Stx2 in ihren nekrotischen und apoptotischen Wirkungen
- 5.2 Inhomogenität der endothelialen Zellkulturen bezüglich der Wirkung von Stx
- 5.2.1 Variierende Todeszeitpunkte von Einzelzellen
- 5.2.2 Unterschiedliche Gb3Cer-Expression in der Zellkultur
- 5.2.3 Zellzyklus-abhängige Stx-Rezeptorexpression auf Endothelzellen
- 5.3 Charakterisierung des vakuolisierenden Toxins EHEC-Vac
- 6 DISKUSSION UND AUSBLICK
- 6.1 Zelluläre Schädigungen von humanen Endothelzellendurch Shiga Toxine
- 6.1.1 Unterschiedliche Pathomechanismen von Stx1 und Stx2bei humanen Endothelzelllinien
- 6.1.2 Differentielle Sensitivitäten von mikro- undmakrovaskulären Endothelzellen
- 6.2 Vakuolisierung von humanen mikrovaskulären Endothelzellen durch EHEC-Vac
- 6.3 Etablierung eines Verfahrens zur dynamischen Überwachung der Zellteilung mittels DHM
- 7 ZUSAMMENFASSUNG
- 8 LITERATURVERZEICHNIS
- 9 ANHANG