Inhalt

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  1.1 Kerntransport
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   1.1.1 Rezeptorvermittelter nucleocytoplasmatischer Transport
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   1.1.2 Kernimport
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   1.1.3 Kernexport
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   1.1.4 Regulation der nucleocytoplasmatischen Partitionierung
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   1.1.5 Transkriptionsregulatoren
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   1.1.6 Die Lichtsignaltransduktion als Beispiel einer Regulation durch nucleocytoplasmatische Partitionierung
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  1.2 MYB Faktoren
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   1.2.1 Struktur und Funktion der MYB-Domäne
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   1.2.2 MYB-Proteine in Tieren
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  1.2.3 MYB-Proteine in Pflanzen
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   1.2.3.1 Einteilung pflanzlicher MYB-Proteine in drei Klassen
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   1.2.3.2 Evolution und verwandtschaftliche Beziehung der MYB-Proteine
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   1.3 Circadiane Rhythmik in A. thaliana
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  1.3.1 Molekulare Zusammensetzung der circadianen Uhr
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   1.3.1.1 Der Input Signalweg
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   1.3.1.2 Der circadiane Oszillator
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   1.3.1.3 Der Output Signalweg
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   1.3.2 Zusätzliche Regulationsebenen des zentralen Oszillators
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   1.4 Zielsetzung
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  2 Material
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   2.1 Chemikalien und Lösungen
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  2.2 Medien
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   2.2.1 Medien für die Anzucht von Bakterien
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   2.2.2 Medien für die Anzucht von Hefen
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   2.2.3 Medien für die Anzucht von Pflanzen
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   2.3 Bakterien- und Hefestämme
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   2.4 Plasmid-Vektoren
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  3 Methoden
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  3.1 DNA-Präparation
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   3.1.1 Aufreinigung und Elution von DNA
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   3.1.2 Auftrennung von DNA
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   3.1.3 Restriktionsverdau von DNA
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   3.1.4 Dephosphorylierungsreaktion
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   3.1.5 Behandlung mit T4 DNA-Polymerase
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   3.1.6 Ligation
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  3.1.7 Transformation von E.coli-Zellen
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   3.1.7.1 Chemotransformation
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   3.1.7.2 Elektrotransformation
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  3.1.8 Plasmid-Isolierung
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   3.1.8.1 Plasmid-DNA Präparation im Minimaßstab (Miniprep)
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   3.1.8.2 Plasmid-DNA Präparation im Großmaßstab (Midiprep)
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   3.1.9 Bestimmung der DNA-Konzentration in einer Lösung
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  3.1.10 Polymerasekettenreaktion
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   3.1.10.1 Standardansatz
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   3.1.10.2 Overlapping extension PCR
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   3.1.11 Isolation von cDNA-Klonen
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  3.2 Analyse von DNA
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   3.2.1 Isolierung genomischer DNA aus pflanzlichem Gewebe
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   3.2.2 Einfache DNA-Isolierung (Shorty Prep)
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   3.2.3 PCR zur Analyse von Shorty Prep-DNA
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  3.3 Analyse von RNA
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   3.3.1 Isolierung von Gesamt-RNA aus wenig Blattmaterial
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   3.3.2 Auftrennung von RNA
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   3.3.3 Northern blot
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   3.3.4 Radioaktive Hybridisierung und Markierung der Sonde
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   3.3.5 RNA Dot Blot Analyse
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  3.3.6 RT-PCR-Analyse
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   3.3.6.1 RNA-Isolation mit RNeasy-Kit für RT-PCR
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   3.3.6.2 Reverse Transkription (RT)
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   3.3.6.3 RT-PCR Reaktion
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   3.4 Hefe Two-Hybrid-Analyse
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   3.4.1 Detektion von Protein-Interaktionen im Y2H-System
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   3.4.2 Hefetransformation
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   3.4.3 Interaktionstest auf Indikatorplatten
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   3.4.4 Quantifizierung der Interaktion zweier Proteine mittels ONPG-Assay
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   3.4.5 Hefe Three-Hybrid Analyse
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  3.4.6 Hefe Two-Hybrid-Screen
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   3.4.6.1 Sequenzielle Transformation und Selektion positiver Kolonien
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   3.4.6.2 Plasmidisolation aus Hefezellen („Plasmid-Rescue“)
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   3.4.6.3 Transformation von E. coli mit isolierten Hefeplasmiden
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   3.4.6.4 Retransformation in Hefe
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   3.5 Hefe One-Hybrid Analyse
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   3.5.1 Herstellung des target-Reporterkonstrukts
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   3.5.2 Integration des target-Reporterkonstrukts in das Hefe-genom
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   3.5.3 Analyse des Reporter-Hefestamms auf Hintergrund-expression
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   3.5.4 Hefe One-Hybrid Assay
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   3.6 EMSA (electrophoretic mobility shift assay)
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   3.6.1 Herstellung des radioaktiv markierten DNA-Fragments
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   3.6.2 In vitro Translation der Proteine
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   3.6.3 DNA-Protein Bindungsassay
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   3.6.4 Gelpräparation und Gellauf
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   3.6.5 Gelanalyse
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   3.6.6 DNA-Kompetitionsanalysen
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   3.6.7 Protein-Kompetitionsanalysen
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  3.7 Analyse der Lokalisation von GFP-Fusionsproteinen
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   3.7.1 Tabak BY-2 Zellkultur
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   3.7.2 Protoplastierung der BY-2 Zellkultur
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   3.7.3 Transfektion der Tabak BY-2 Protoplasten
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   3.7.4 Lokalisation von GFP-Fusionsproteinen
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   3.8 BiFC (bimolecular fluorescence complementation)
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   3.8.1 Konstruktion der Split-YFP-Vektoren und Klonierung der cDNAs
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   3.8.2 Analyse der BiFC-Interaktionen
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  3.9 Anzucht von A. thaliana
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   3.9.1 Anzucht auf Erde
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   3.9.2 Sterile Anzucht von A. thaliana
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  3.10 Transformation von A. thaliana
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   3.10.1 Transformation von Agrobakterien
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   3.10.2 Agrobakterien-vermittelte Transformation von A. thaliana
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   3.10.3 Selektion transgener A. thaliana Pflanzen
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  3.11 Promotor-GUS Analysen
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   3.11.1 Herstellen der Promotor-GUS Pflanzen
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   3.11.2 Histochemischer Nachweis von GUS in Pflanzen
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   3.11.3 Herstellen von Gewebeschnitten
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  3.12 In planta Analyse des LCL1 Exports
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   3.12.1 Herstellung der YFP-Fusionsproteine
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   3.12.2 Expressionsanalyse der EYFP-LCL1- bzw. -LCL1(NESmut)-Pflanzen
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   3.12.3 LMB-vermittelte Hemmung des Exports von LCL1
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   3.13 Analyse der LCL1 T-DNA Insertionslinien
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   3.14 RNA interference (RNAi)
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   3.14.1 Herstellen des RNAi-Konstrukts
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   3.14.2 Herstellen und Analyse transgener RNAi-Pflanzen
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  3.15 Überexpression von LHY MYB-Proteinen in planta
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   3.15.1 Überexpression von LCL1 und LCL1(NESmut)
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   3.15.2 Überexpression der MYB-Domäne von LCL1
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   3.15.3 Überexpression von LHY
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  4 Ergebnisse
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  4.1 Analyse des nucleocytoplasmatischen Transports von LCL1
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   4.1.1 Interaktion von LCL1 mit XPO1 und Identifizierung der NES
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   4.1.2 Quantitative Analyse der -Galaktosidase Aktivität
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   4.1.3 Lokalisation von GFP-LCL1 Proteinen und Identifizierung der NLS
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  4.1.4 Analyse des Kernexports von LCL1 in planta
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   4.1.4.1 Expressionsanalyse der YFP-LCL1/LCL1(NESmut)-Pflanzen
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   4.1.4.2 LMB-Experiment
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   4.2 Sequenzvergleich der LHY MYB Familie
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  4.3 Bindung der LHY MYB Proteinfamilie an das evening element
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   4.3.1 Hefe One-Hybrid Analyse
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   4.3.2 EMSA (electrophoretic mobility shift assay)
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  4.4 Dimerisierungspotential der LHY MYB Familie
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   4.4.1 Charakterisierung der Dimerisierungsdomäne von LCL1
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   4.4.2 Dimerisierung von LCL2-LCL5 und EPR1 und Interaktion mit XPO1
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   4.4.3 Dimerisierungspotential von LHY und CCA1 im Y2H-System
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   4.4.4 BiFC (bimolecular fluorescence complementation)
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   4.4.5 Identifizierung neuer Interaktionspartner von LCL1
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   4.4.6 Dimerisierungspotential von LIP26
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   4.4.7 Hefe Three-Hybrid Assay mit CCA1, LCL1 und XPO1
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  4.5 Analyse der Lokalisation von GFP-Fusionsproteinen
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   4.5.1 GFP-LCL-Fusionsproteine
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   4.5.2 GFP-Fusionen mit den Clock-Proteinen
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  4.6 Expression von LCL1
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   4.6.1 Circadiane Expression von LCL1
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   4.6.2 Lokalisation der LCL1-Promotoraktivität in A. thaliana
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  4.7 Analyse transgener A. thaliana Pflanzen
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   4.7.1 LCL1 T-DNA Insertionslinien
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   4.7.2 LCL-RNAi Pflanzen
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  4.7.3 LHY MYB-überexprimierende Pflanzen
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   4.7.3.1 LCL1- und LCL1(NESmut)-überexprimierende Pflanzen
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   4.7.3.2 Überexpression der MYB-Domäne von LCL1 in A. thaliana
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   4.7.3.3 LHY-überexprimierende Pflanzen
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  5 Diskussion
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  5.1 Charakterisierung der Proteindomänen
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   5.1.1 Die LHY MYB family Domäne
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   5.1.1.1 Bindung an das evening element
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   5.1.1.2 Charakterisierung der NLS von LCL1
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   5.1.2 Die LCL-Domäne
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   5.1.2.1 Charakterisierung der NES von LCL1
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   5.1.2.2 Nucleocytoplasmatische Shuttle-Proteine
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  5.2 Protein-Dimerisierungspotential
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   5.2.1 Interaktionen der LCL-Proteine
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   5.2.2 Interaktionen der Clock-Proteine
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   5.2.3 Neue Interaktionspartner von LCL1
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   5.2.4 Charakterisierung der Proteindimerisierungsdomäne
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   5.2.5 Zelllokalisation der Monomere und Dimere
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  5.3 Expression und in planta Lokalisation von LCL1
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   5.3.1 Circadiane Expression
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   5.3.2 Lokalisation der LCL1-Promotoraktivität in A. thaliana
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  5.4 Experimente zur Analyse der Funktion von LCL1
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   5.4.1 LCL1 T-DNA Insertionslinien
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   5.4.2 LCL-RNAi Pflanzen
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   5.4.3 LCL1- und LCL1(NESmut)-überexprimierende Pflanzen
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   5.4.4 Überexpression der LCL1 MYB-Domäne
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   5.4.5 LHY-überexprimierende Pflanzen
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   5.5 Die mögliche Rolle von LCL1 im zentralen Oszillator
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   5.6 Perspektiven
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   6 Zusammenfassung
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   7 Literatur
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  8 Anhang
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   8.1 Oligonukleotide
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   1.1
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   8.2 Abkürzungsverzeichnis
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   8.3 Publikationen