Ehling, Daniela: Etablierung von DNA-Sonden zur Detektion numerischer und struktureller Aberrationen der Chromosomen 13, 21 und 22 mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung [...]. 2003
Inhalt
- Inhaltsverzeichnis
- Zusammenfassung
- Einleitung
- Chromosomenaberrationen
- Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)
- Numerische und strukturelle Aberrationen des Chromosoms 13
- Numerische und strukturelle Aberrationen des Chromosoms 21
- Strukturelle Aberrationen des Chromosoms 22
- Ziel der Arbeit
- Material und Methoden
- Material
- Humane BAC-Bank
- Humane YAC-Bank
- Oligonukleotide
- D21S167-for
- D21S167-rev
- D21S259-for
- D21S259-rev
- D21S266-for
- D21S266-rev
- D21S270-for
- D21S270-rev
- D21S1252-for
- D21S1252-rev
- DNA-Längenstandard:
- Enzyme
- Taq DNA-Polymerase in HotStarMastermix
- Reagenzien und Antikörper für den Fluoreszenznac
- verwendete Konzentration
- Hersteller
- Antikörper der Biotin Detektion
- Antikörper der Digoxigenin Detektion:
- Verwendete käufliche Systeme \(Kit\):
- QIAquick PCR
- Purification Kit
- Chromosom 22 Probenmaterial
- Zelllinien
- Zellkulturmedien und Zusätze
- Hersteller
- Medienzusammensetzung
- Verwendete Datenbanken:
- Methoden:
- Kultivierung von Bakterienzellen
- Glycerinkulturen
- Kultivierung von Zellen
- Chromosomenpräparation aus peripherem Blut
- May-Grünwald/ Giemsa-Färbung
- DNA-Präparationsmethoden
- Konzentrationsbestimmung isolierter Nukleinsäure
- DNA Aufreinigung aus Agarosegelen mit dem QIAquick Gel Extraktion Kit
- Aufreinigung von PCR-Produkten
- Restriktionsspaltung
- Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten
- Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- Standard-PCR
- PCR für das Durchmustern einer BAC-Bibliothek
- Kolonie-PCR
- Halb-quantitative PCR
- Degenerate Oligonucleotide-Primed PCR (DOP-PCR)
- Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)
- Markierung der DNA-Sonden durch DOP-PCR
- Markierung der DNA-Sondern durch Nick-Translation
- Markierung der DNA-Sondern durch BioPrime (LifeTechnologies)
- Aufarbeitung der markierten DNA-Sonden
- Vorbehandlung und Denaturierung der Chromosomenpr
- Hybridisierung
- Waschen der hybridisierten Chromosomenpräparate
- Detektion der Biotin bzw. Digoxigenin markierter DNA-Sonden
- Gegenfärbung der DNA
- Fluoreszenzmikroskopie und Dokumentation
- Fallbeschreibungen
- Ergebnisse
- Etablierung von BAC-Klonen für die Chromosomen 1
- Nachweis von Deletion in 22q11 an Patientenmaterial
- Charakterisierung des Bruchpunktintervalls einer partiellen Trisomie des Chromosoms 21 (CMI)
- Bruchpunktanalysen in zwei Fällen partieller Mon
- FISH-Analysen zur Aufklärung der Deletionsregion
- Eingrenzung der Bruchpunktregion mit YAC-Klonen (Patientin JP)
- Eingrenzung der Bruchpunktregion mit ETS2 spezifischen Klonen (Patientin JP)
- Eingrenzung der Bruchpunktregion mit Einzelkopie FISH-Sonden (Patientin JP)
- Mikrosatellitenanalysen der Patientin JP und der Eltern
- FISH-Analyse der partiellen Monosomie 21 (Patient SR)
- Diskussion
- Vorteile von BAC-Klonen für die FISH
- Chromosom 13 spezifische BACs
- Chromosom 21 spezifische BACs
- Chromosom 22 spezifische BACs
- FISH-Analysen von Patienten mit einer Deletion in 22q11
- Molekular zytogenetische Analysen der Patientin CMI mit einer partiellen Trisomie 21
- Molekular zytogenetische Analysen der Patienten JP und SR mit einer partiellen Monosomie 21
- Haplotypen Analysen der partiellen Trisomie 21 (CMI) und der partiellen Monosomien 21 (JP)
- Schlußbemerkungen
- Literaturverzeichnis
- Anhang