Larisch, Christof: Charakterisierung des Sigmafaktors SigB aus Corynebacterium glutamicum und seiner Rolle bei der Genexpression in der Transitionsphase des Wachstums. 2006
Inhalt
- INHALTSVERZEICHNIS
- I. Zusammenfassung
- II. Einleitung
- 1 Die Gattung Corynebacterium
- 1.1 Taxonomie der Corynebakterien
- 1.2 Wirtschaftliche Bedeutung der Corynebakterien
- 1.3 Corynebacterium glutamicum im Zeitalter der functional genomics
- 2 Sigmafaktoren bei Bakterien
- 2.1. Die zwei Familien der bakteriellen Sigma-Faktoren, (54 und (70
- 2. Die (54-Familie
- 2.3 Die (70-Familie
- 2.3.1 Haupt-(-Faktoren
- 2.3.2 Nicht- essentielle (-Faktoren
- 2.3.3 Die alternativen (-Faktoren
- 2.4 Die Sigmafaktoren von Corynebacterium glutamicum
- 3 Ziele dieser Arbeit
- III. Material und Methoden
- 1 Bakterienstämme und Plasmide
- 2 Enzyme, Chemikalien und andere Materialien
- 2.1 Enzyme und Marker
- 2.2 Chemikalien
- 2.3 Materialien
- 2.4 Kits
- 2.5 Geräte und Apparaturen
- 2.6 Software
- 3 Medien und Zusätze
- 3.1 Nährmedien
- 3.2 Zusätze zu den Nährmedien
- 3.3 Puffer und Lösungen
- 3.3.1 Lösungen für Fermentation
- 3.3.2 DNA-Isolierung und -Reinigung
- 3.3.3 DNA-Transfer
- 3.3.4 Puffer und Lösungen für Vakuum-Blot und Hybridisierung
- 3.3.5 Gelelektrophorese
- 3.3.6 DNA-Amplifizierung mittels PCR
- 3.3.7 DNA-Restriktionsspaltung
- 3.3.8 RNA-Isolierung
- 3.3.9 Array-Hybridisierung
- 4 Kultivierung von Bakterien
- 4.1 Anzucht und Lagerung von Bakterien
- 4.2 Bestimmung des Bakterientiters
- 4.3 Stochertest
- 4.4 Anzucht der Bakterien im Fermenter
- 4.5 Fermenterparameter:
- 4.5.1 Animpfen des Fermenters
- 4.5.2 Begasungsumstellung
- 4.5.3 Probenahme
- 4.5.4 Glukosebestimmung
- 4.5.5 Bestimmung der Verdopplungszeit td
- 5 DNA-Isolierung
- 5.1 Gesamt-DNA-Isolierung aus C. glutamicum
- 5.2 Plasmid-DNA Isolierung mit dem QIAquick® Spin Miniprep Kit
- 5.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mit dem QIAquick® Gel Extraction Kit
- 6 DNA-Reinigung
- 6.1 PCR-Produkt-Aufreinigung mit dem QIAquick® PCR Purification Kit
- 6.2 Sephadex G50-Säulenchromatographie
- 7 DNA-Analyse
- 8 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- 8.1 Primer Design
- 8.2 PCR-Reaktionsansätze und Programme
- 8.2.1 PCR-Reaktionsansatz für Pwo-Polymerase
- 8.2.2 PCR-Programm für Pwo-Ploymerase
- 8.2.3 PCR-Reaktionsansatz für Pfu-Polymerase
- 8.2.4 PCR-Programm für Pfu-Ploymerase
- 8.2.5 PCR-Reaktionsansatz für Taq-Polymerase
- 8.2.6 PCR-Programm für Taq-Ploymerase
- 9 Gene-Splicing by Overlap Extension
- 10 Klonierungsexperimente
- 10.1 DNA-Restriktionsspaltung
- 10.1.1 Spaltungsansatz für Plasmide
- 10.1.2 Spaltungsansatz für DNA-Fragmente
- 10.2 DNA-Ligation
- 10.2.1 Ligationsansatz für T4-Ligase von MBI Fermentas
- 10.3 Identifizierung rekombinanter Plasmide durch Blau-Weiß-Selektion
- 11 Hybridisierung von DNA (nach Southern, 1975)
- 11.1 DNA-Transfer durch Vakuum-Blotting
- 11.2 Nicht-radioaktive DNA-Markierung mit Digoxigenin-dUTP
- 11.3 Nicht-radioaktive Hybridisierung
- 11.4 Digoxigenin-Nachweis
- 12 DNA-Transfertechniken
- 12.1 Elektroporation
- 12.1.1 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
- 12.1.2 Elektroporation nach E. coli
- 12.1.3 Herstellung kompetenter C. glutamicum-Zellen
- 12.1.4 Elektroporation nach C. glutamicum
- 13 Gesamt-RNA-Isolierung aus C. glutamicum (Qiagen Manual modifiziert)
- 14 Microarray-Hybridisierung
- 14.1 Labeling
- 14.1.1 RT-Reaktion
- 14.1.2 Hydrolyse
- 14.1.3 Reinigung der cDNA mit dem MinElute™ PCR Purification Kit
- 14.1.4 Photometrische Bestimmung der cDNA Konzentration
- 14.1.5 Kopplung der Fluoreszenzfarbstoffe
- 14.1.6 Quenching
- 14.1.7 Reinigung der cDNA mit dem MinElute™ PCR Purification Kit
- 14.1.8 Kontroll-Gel
- 14.2 Array-Hybridisierung
- 14.2.1 Arrays waschen
- 15 Expressionsanalyse am LightCycler
- 16 5´-RACE-PCR
- 17 DNA Sequenzierung
- IV. Ergebnisse
- 1 Molekulargenetische Charakterisierung von sigB aus C. glutamicum
- 1.1 Erzeugung einer sigB-Deletionsmutante
- 1.2 Expressionsstudien von sigB nach Stressapplikation
- 1.3 Charakterisierung des Wildtyps und der ΔsigB-Mutante nach Stressapplikation mittels Lebendtiterbestimmung
- 1.4 Vergleichende Wachstumsanalysen des Wildtyps und der sigB-Deletionsmutante mittels Schüttelkolbenkultivierung
- 1.5 Vergleichende Wachstumsanalysen des Wildtyps und der sigB-Deletionsmutante mittels Schüttelkolbenkultivierung nach Stressapplikation
- 1.6 Untersuchungen der sigB-Expression im Verlauf einer Wachstumsphase
- 1.7 Identifizierung der Wachstumsphasenregulation durch eine sigB-Überexpression
- 2 Identifizierung des SigB-Regulons von C. glutamicum
- 2.1 Glukose-limitierte batch-Fermentation von C. glutamicum und Bestimmung der maximalen Wachstumsgeschwindigkeit µ sowie der Verdopplungszeit td
- 2.2 Glukose-limitierte batch-Fermentation von C. glutamicum CL1 und Bestimmung der maximalen Wachstumsgeschwindigkeit µ sowie der Verdopplungszeit td
- 3.1 Vergleichende transkriptionelle Analyse des C. glutamicum-Wildtyps während der exponentiellen Wachstumsphase und der Transitionsphase
- 3.2 Vergleichende transkriptionelle Analyse der C. glutamicum sigB-Deletionsmutante CL1 während der exponentiellen Wachstums-phase und der Transitionsphase
- 3.3 Analyse der Gene, die während der Transitionsphase in Abhängig keit von SigB unterschiedlich stark transkribiert werden
- 3.3 In silico- und in vivo-Identifizierung der SigB-Konsensus-Promotor-sequenz von C. glutamicum
- 3.4 Charakterisierung des Expressionsverhaltens von SigB-regulierten Genen über den Wachstumsverlauf in der sigB-Deletionsmutante CL1
- V. Diskussion
- SigB ist der nicht-essentielle Sigmafaktor in C. glutamicum, der in die Stressantwort involviert ist
- SigB ist ein negativer Wachstumsregulator in C. glutamicum
- SigB und SigA erkennen ähnliche Promotorsequenzen in C. glutamicum
- VI. Literaturverzeichnis:
- VII. Anhang