Siemann, Stefan: Untersuchungen zur Bildung Wolfram- und Rhenium-haltiger Nitrogenasen in Rhodobacter capsulatus und zur Biosynthese des FeMo-Cofaktors in einer nifE- [...]. 2000
Inhalt
- Einleitung
- Die biologische Stickstoff-Fixierung
- Die konventionelle, Molybdän-abhängige Nitrogenase
- Alternative, Molybdän-unabhängige Nitrogenase-Systeme
- Funktion des Heterometalls in den Cofaktoren
- Biosynthese der Cofaktoren
- Molybdän-Aufnahme in R. capsulatus und anderen Organismen
- Ziele dieser Arbeit
- Material und Methoden
- Organismen
- Nährmedien
- Zellanzucht
- Extinktionsmessung von Zellsuspensionen
- Gewährleistung anaerober Bedingungen
- Bereitung von O2-freien Gasen
- Vorbereitung von Gefäßen, Spritzen und Lösungen
- Überprüfung des Reduktionszustandes
- Zellernte
- Zellaufschluss zur Herstellung von Extrakten
- Reinigung der Nitrogenasekomponenten
- Bestimmung der Nitrogenaseaktivität
- Proteinbestimmung
- Proteinbestimmung ganzer Zellen
- Proteinbestimmung zellfreier Extrakte
- Proteinbestimmung nach Bradford
- Analytische SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
- Proteinmarker zur Molekulargewichtsbestimmung
- Probenvorbereitung
- Tris-Glycin-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
- Tris-Tricin-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
- Färbung der Proteinbanden
- Immunologische Methoden
- EPR-spektroskopische Untersuchungen
- Redoxtitration
- Probenvorbereitung (Gelfiltration mit Sephadex G-25)
- Mediatorenlösung
- Durchführung der Redoxtitration
- Metallanalysen
- Metallaufnahme von R. capsulatus-Zellen
- Probenvorbereitung für Metallanalysen
- Metallanalysen durch ICP-MS
- Konstruktion einer nifE- anfA- -Doppelmutante
- Chemikalien
- E
- Ergebnisse
- Einfluss der MoO42-- und WO42--Konzentration im Nährmedium auf die in-vivo-Aktivität einer anfA- Mutante von R. capsulatus
- Einfluss von MoO42- und WO42- im Nährmedium auf die Expression der Nitrogenase
- Einfluss von MoO42- im Nährmedium auf die Expression der Nitrogenase
- Einfluss von WO42- im Nährmedium auf die Expression der Nitrogenase
- Quantifizierung des gebildeten MoFe-Proteins durch radiale Immundiffusion
- Identifizierung des 27 kDa-Proteins als Protein des „High-Affinity“-Molybdän-Transport (HAMT)-Systems
- Präparation und Isolierung einer W-haltigen Nitrogenase
- Charakterisierung der W-haltigen Dinitrogenase („WFe-Protein“)
- Bestimmung der Nitrogenaseaktivität
- Metallgehalt der isolierten Dinitrogenase-Komponente aus „W-Zellen“
- EPR-spektroskopische Charakterisierung der Wolfram-haltigen Nitrogenase
- EPR-Spektrum der „Enzym-reduzierten“ W-haltigen Nitrogenase („Turnover“-Zustand)
- Redoxtitration der W-haltigen Nitrogenase
- Versuche zur Isolierung einer W-haltigen Nitrogenase aus dem alternativen Nitrogenase-System von R. capsulatus
- Einfluss der WO42-- bzw. MoO42--Konzentration im Nährmedium auf die Aktivität ganzer Zellen einer ?nifHDK ?mod-Mutante
- Einfluss von WO42- auf die Expression der Fe-Nitrogenase
- Untersuchungen zur Bildung einer Rhenium-Nitrogenase aus R. capsulatus
- Einfluss von ReO4- auf das Zellwachstum und die Nitrogenaseaktivität
- Aufnahme von MoO42- in Zellen einer anfA--Mutante
- Aufnahme von ReO4- in Zellen einer anfA--Mutante
- Abhängigkeit der in-vivo Nitrogenaseaktivität verschiedener nifE--Mutanten von der MoO42--Konzentration im Nährmedium
- Expression des MoFe-Proteins in Zellen der apolaren nifE--Mutante
- Einfluss der MoO42--Konzentration im Nährmedium auf die MoFe-Protein-bildung
- Einfluss der Kultivierungsdauer auf die Expression des MoFe-Proteins
- Abhängigkeit der C2H6-Bildung von der Kultivierungsdauer der nifE--Zellen
- Diazotrophes Wachstum der nifE--Mutante
- Inhibierungsversuche mit Kohlenmonoxid
- Isolierung und Identifizierung des FeMoco-enthaltenden MoFe-Proteins aus der nifE--Mutante
- Vergleich der EPR-Spektren von ganzen Zellen und dem isolierten MoFe-Protein
- D
- Diskussion
- Einfluss der MoO42-- und WO42--Konzentration im Nährmedium auf die Bildung und Aktivität der Nitrogenase von R. capsulatus
- Einfluss von MoO42- auf die Expression der Nitrogenase von R. capsulatus
- Einfluss von WO42- auf die Expression der Nitrogenase von R. capsulatus
- Isolierung und Charakterisierung der W-haltigen Nitrogenase aus R. capsulatus
- Isolierung der W-haltigen Nitrogenase
- EPR-spektroskopische Charakterisierung der W-haltigen Nitrogenase
- Redoxtitration der W-haltigen Nitrogenase
- Zur Bedeutung W-haltiger Enzyme und Nitrogenasen
- Zusammenfassung
- Literaturverzeichnis
- Publikationen
- Danksagung
- Lebenslauf